聚合酶鏈反應(yīng)(PCR，Polymerase Chain Reaction)由Kary Mullis博士于20世紀(jì)80年代開發(fā)。該技術(shù)因其識(shí)別特定DNA序列并快速準(zhǔn)確地合成大量副本的能力而被比作“分子復(fù)印機(jī)”。目前開發(fā)了各種基于原始PCR方法的衍生技術(shù)。實(shí)時(shí)PCR，也稱為定量PCR(qPCR)，將PCR放大和檢測(cè)結(jié)合在一步中。另一種稱為逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的技術(shù)使用RNA作為核酸起始模板。

● PCR：包含DNA模板、DNA聚合酶、引物和dNTPs的反應(yīng)混合物的重復(fù)加熱和冷卻循環(huán)。[1]每個(gè)循環(huán)都會(huì)使DNA的數(shù)量增加一倍左右，因?yàn)樵谙乱粋�(gè)循環(huán)中，一條新的DNA鏈會(huì)成為復(fù)制的模板。這導(dǎo)致DNA數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng)。

圖1 PCR的第一個(gè)循環(huán)[1]

● RT-PCR(Reverse transcription PCR)：反轉(zhuǎn)錄PCR可以使用RNA作為模板，生成互補(bǔ)DNA(cDNA)。使用逆轉(zhuǎn)錄酶可生成cDNA的單鏈拷貝。這可以使用與RNA的PolyA尾部相結(jié)合的寡聚體(dT)引物，或使用隨機(jī)六聚體（六至九個(gè)堿基長(zhǎng)的引物，在RNA轉(zhuǎn)錄物的多個(gè)點(diǎn)上進(jìn)行結(jié)合）來完成。一般來說，兩種引物的混合被認(rèn)為是最好的，因?yàn)樗�能夠放大PolyA尾RNA（主要是mRNA）和不含PolyA的RNA（tRNA、rRNA等）。然后再用DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，生成雙鏈cDNA，送入基于PCR的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增過程。

● qPCR(Quantitative PCR)：是指定量實(shí)時(shí)PCR，即實(shí)時(shí)對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過熒光探針（最常見的是插層染料或水解探針）進(jìn)行測(cè)量，從而對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量。用于檢測(cè)病原體的存在，并確定相關(guān)DNA序列的拷貝數(shù)。SYBR Green I是最常用的DNA結(jié)合熒光染料，當(dāng)與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的濃度成正比增長(zhǎng)。

與標(biāo)準(zhǔn)PCR相比，定量PCR的優(yōu)勢(shì)在于無需瓊脂糖凝膠就能實(shí)時(shí)觀察到哪些反應(yīng)起了作用。它還能進(jìn)行真正的定量分析。

● RT-qPCR(Reverse Transcription Quantitative real-time PCR)：這是一種將RT-PCR與qPCR相結(jié)合的技術(shù)，用于反轉(zhuǎn)錄定量實(shí)時(shí)PCR。通過在qPCR反應(yīng)中使用cDNA來測(cè)量RNA水平，從而快速檢測(cè)基因表達(dá)的變化。

RT-qPCR可用于研究用抑制劑、刺激劑、小干擾RNA(siRNA)或基因敲除模型等處理模型系統(tǒng)時(shí)基因表達(dá)的變化。這項(xiàng)技術(shù)還經(jīng)常用于檢測(cè)RNA-Seq實(shí)驗(yàn)之前（作為質(zhì)量控制）和之后（確認(rèn)變化）的表達(dá)變化。

RT-qPCR樣品制備的最后一步是產(chǎn)生cDNA。除了考慮引物外，cDNA的生成可以是qPCR實(shí)驗(yàn)（稱為一步RT-qPCR）的一部分，也可以與qPCR（兩步RT-qPCR）分開生成（圖3）。

圖2 RT-PCR, qPCR and RT-qPCR示意圖 [2]

圖3 一步法RT-qPC和兩步法RT-qPCR[2]

● ddPCR(Droplet-based Digital PCR)：樣本穿過微流控芯片形成一種分段流，其中樣本被分成數(shù)萬個(gè)液滴可以充當(dāng)PCR反應(yīng)室，這些液滴被不混溶的液體（例如礦物油）分離，形成乳液[3]。將乳液收集在小瓶中，進(jìn)行PCR，隨后通過流式細(xì)胞儀處理樣本，以計(jì)數(shù)PCR陽(yáng)性的液滴數(shù)量�；�?qū)⑷橐核腿胨芰闲酒�中，形成單層液滴，進(jìn)行熱循環(huán)并捕獲并評(píng)估液滴的熒光圖像[4]。與qPCR相比，ddPCR具有精確度更高、絕對(duì)定量變異系數(shù)更低的優(yōu)點(diǎn)[5]。PCR多重化通常通過基于探針的熒光進(jìn)行，每個(gè)DNA/RNA具有不同的激發(fā)顏色。也用于生成單細(xì)胞RNA測(cè)序的庫(kù)。

圖4 ddPCR示意圖[6]

參考文獻(xiàn)：
[1] Jalali M, Zaborowska J, Jalali M. The polymerase chain reaction: PCR, qPCR, and RT-PCR[M]//Basic science methods for clinical researchers. Academic Press, 2017: 1-18.
[2] Zhang H, Tang K, Wang B, Duan CG, Lang Z, Zhu JK. Protocol: a beginner's guide to the analysis of RNA-directed DNA methylation in plants. Plant Methods. 2014 Jun 14;10:18. doi: 10.1186/1746-4811-10-18. PMID: 24955108; PMCID: PMC4065543.
[3] Schiffman M, Bauer H, Lorincz A et al. Comparison of Southern blot hybridization and polymerase chain reaction methods for the detection of human papillomavirus DNA. J. Clin. Microbiol.29(3), 573–577 (1991).
[4] Madic J, Zocevic A, Senlis V et al. Three-color crystal digital PCR. Biomol. Detect. Quant. 10, 34–46 (2016).
[5] Hindson CM, Chevillet JR, Briggs HA et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nat. Methods 10, 1003 (2013).
[6] Hwang B, Lee JH, Bang D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 2018 Aug 7;50(8):1-14. doi: 10.1038/s12276-018-0071-8. Erratum in: Exp Mol Med. 2021 May;53(5):1005. doi: 10.1038/s12276-021-00615-w. PMID: 30089861; PMCID: PMC6082860.