多組學構(gòu)建癌癥m6A甲基化圖譜并揭示腫瘤惡化關(guān)鍵機制的研究
2025年3月24日，加拿大瑪格麗特公主癌癥中心/多倫多大學何厚勝（Housheng Hansen He）團隊在《Nature Genetics》（IF29/Q1）上發(fā)表了題為“The landscape of N6-methyladenosine in localized primary prostate cancer”的科研成果。研究對162例局限性原發(fā)前列腺癌樣本的m6A甲基化修飾圖譜進行系統(tǒng)性探索，并結(jié)合m6A表觀轉(zhuǎn)錄組（meRIP-seq）、基因組（WGS）、轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）和蛋白組等多組學數(shù)據(jù)，揭示了m6A修飾在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的多層級調(diào)控機制（包括種系遺傳風險、微環(huán)境失調(diào)、體細胞突變和轉(zhuǎn)移等），確立了整體和位點特異性m6A模式均具有潛在的生物標志物價值。
本研究發(fā)現(xiàn)m6A修飾在不同患者中具有顯著性差異，其整體模式受種系遺傳和體細胞協(xié)同調(diào)控，鑒定出的5種m6A患者亞型（P1-P5）和5種m6A修飾亞型（M1-M5），與腫瘤分級、腫瘤大小、侵襲性導管內(nèi)癌和篩狀結(jié)構(gòu)（IDC/CA）分型、基因組不穩(wěn)定性及術(shù)后復發(fā)密切相關(guān)。研究進一步鑒定出1,350個m6A數(shù)量性狀位點（m6A-QTLs），揭示種系遺傳變異對m6A水平的調(diào)控，并證實缺氧微環(huán)境可介導m6A譜系改變。此外，功能驗證表明，VCAN等基因上的m6A位點通過IGF2BP蛋白家族調(diào)控mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率，直接促進腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，且與患者不良預后顯著相關(guān)�？傮w而言，本研究揭示了m6A修飾與遺傳背景、微環(huán)境及腫瘤表型之間的復雜互作，為開發(fā)新型預后標志物和治療靶點提供了重要理論依據(jù)。
英文標題：The landscape of N6-methyladenosine in localized primary prostate cancer
中文標題：局限性原發(fā)前列腺癌中的m6A甲基化圖譜
發(fā)表時間：2025-3-24
發(fā)表期刊：Nature Genetics
影響因子：IF29/Q1
技術(shù)平臺：MeRIP-seq、RNA-seq、H3K27ac ChIP、WGS、蛋白組等
作者單位：加拿大多倫多大學、美國加州大學洛杉磯分校等
DOI：10.1038/S41588-025-02128-y
圖形摘要：m6A修飾通過IGF2BP蛋白穩(wěn)定VCAN mRNA并促進其翻譯，從而增強前列腺癌細胞侵襲
研究方法
隊列與樣本：
研究納入了162例經(jīng)根治性前列腺切除術(shù)治療的、國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）中危局限性前列腺癌患者的治療前腫瘤樣本，并進行了嚴格的質(zhì)控，最終148例樣本進入最終分析隊列。
多組學策略：
- m6A MeRIP-seq：繪制前列腺癌全轉(zhuǎn)錄組m6A修飾圖譜，并基于peak水平的m6A豐度進行共識聚類分析，鑒定出5種m6A患者亞型（P1-P5）和5種m6A修飾亞型（M1-M5）。
- 多組學整合：每例樣本均匹配全基因組測序（148例）、DNA甲基化（146例）、H3K27ac ChIP-seq（29例）、超深度RNA-seq（92例）和蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)（54例），評估m(xù)6A與其他分子特征（如RNA豐度、拷貝數(shù)變異、DNA甲基化）之間的復雜關(guān)聯(lián)，并在全基因組范圍內(nèi)鑒定出m6A數(shù)量性狀位點（m6A-QTLs），形成完整的中心法則調(diào)控鏈數(shù)據(jù)集。
臨床相關(guān)性分析：
- 生存分析：Cox比例風險模型評估m(xù)6A特征與患者復發(fā)（BCR）風險之間的關(guān)聯(lián)。隨機效應Meta分析整合6個獨立隊列（1,239例）驗證m6A調(diào)控基因的預后價值。
- 功能驗證實驗：在PC-3等前列腺癌細胞系中，通過shRNA/siRNA敲低、dCasRx-METTL3系統(tǒng)進行位點特異性m6A writer、RIP-qPCR驗證IGF2BP蛋白結(jié)合、核糖體圖譜分析翻譯效率、雞胚模型檢測細胞外滲能力，驗證了VCAN等關(guān)鍵基因的m6A修飾功能。
（1）局限性前列腺癌的m6A修飾圖譜
研究首先通過MeRIP-seq技術(shù)對148例質(zhì)量合格的前列腺癌樣本進行深度測序，系統(tǒng)描繪了局限性前列腺癌的全轉(zhuǎn)錄組m6A修飾圖譜。分析顯示，前列腺癌中m6A Peak數(shù)量呈高度異質(zhì)性，中位值為7,611±2,922個，部分腫瘤可檢測超過12,000個Peaks（圖1a）。同時，m6A分布具有異質(zhì)性，約16%的Peaks（5,146個）僅在單個樣本中被鑒定，約20%（6,467個）在至少一半樣本中出現(xiàn)，僅0.5%（167個）在所有樣本中均被檢測到（圖1f）。值得注意的是，關(guān)鍵前列腺促癌基因如AR、MYC、MALAT1和FOXA1頻繁發(fā)生m6A甲基化，而抑癌基因TP53、PTEN和RB1則極少被修飾，這種"促癌基因偏好性"提示m6A可能參與轉(zhuǎn)錄后致癌程序。
此外，研究鑒定出32,051個高置信度聯(lián)合Peak，這些Peak顯著富集于終止密碼子附近和3' UTR區(qū)，符合m6A調(diào)控mRNA穩(wěn)定性的經(jīng)典模式�；バ畔⒎治鼋沂緈6A與RNA豐度在約20%基因（839個）中存在顯著關(guān)聯(lián)，且整體呈負相關(guān)，支持m6A介導mRNA降解的功能，但與蛋白質(zhì)豐度、拷貝數(shù)變異、DNA甲基化等其他分子特征關(guān)聯(lián)較少（圖1g）。
圖1：前列腺癌m6A修飾圖譜
（2）前列腺癌的m6A亞型和臨床相關(guān)性
通過對5,203個m6A Peak進行共識聚類，研究鑒定出具有不同m6A模式的5種患者亞型（P1-P5）和5種m6A亞型（M1-M5）（圖2a）。這些m6A亞型與多個臨床病理特征相關(guān)（圖2b），包括腫瘤大小和范圍（病理T分期，pT）（圖2c）、侵襲性導管內(nèi)癌和篩狀結(jié)構(gòu)（IDC/CA）陽性率（圖2d）、基因組不穩(wěn)定性以及術(shù)后復發(fā)率（圖2e）。從分子機制角度來說，不同亞型攜帶特征性的m6A調(diào)控因子變異，P4亞型富集YTHDF1基因擴增（圖2g），而P2亞型常見FANCA基因缺失（圖2h），這些變異表現(xiàn)出m6A writer、eraser、reader基因的體細胞拷貝數(shù)變異特征模式。
此外，研究鑒定出與關(guān)鍵臨床指標（年齡、病理分級、IDC/CA狀態(tài)等）相關(guān)的m6A位點。發(fā)現(xiàn)了8個m6A Peaks與病理ISUP分級相關(guān)（圖2i），13個Peaks與IDC/CA狀態(tài)相關(guān)。其中，NSD1基因上的m6A Peak豐度在IDC/CA陽性腫瘤中顯著升高（圖2j），而NSD1已知可增強雄激素受體（AR）轉(zhuǎn)錄激活，提示m6A可能通過調(diào)控AR信號軸促進結(jié)構(gòu)侵襲。
圖2：m6A的分子分型與臨床相關(guān)性
鑒于前列腺癌是最具遺傳性的實體瘤之一，研究深入探討了種系遺傳對m6A甲基化的調(diào)控作用。在約600M的種系多態(tài)性（SNP）中，篩選出4,755個位于已注釋m6A位點的SNP，其中35個與MeRIP-seq鑒定的Peak重疊且等位基因含有A堿基。等位基因頻率分析顯示，活性m6A位點中A等位基因頻率顯著高于非活性位點（中位值0.83 vs 0.45），提示非A等位基因與m6A豐度降低相關(guān)（圖3a-f）。
通過m6A-QTL分析，在全基因組范圍內(nèi)鑒定出14,775個顯著關(guān)聯(lián)的m6A-QTL，涵蓋1,350個特異性Peak（圖3g）。其中11%的SNP直接位于Peak內(nèi)，4%與Peak存在HiChIP驗證的染色質(zhì)環(huán)互作，揭示遠端調(diào)控的可能。代表性案例是rs4951018與SLC45A3基因m6A、RNA和蛋白豐度的三重關(guān)聯(lián)（圖3h），該基因是前列腺癌常見融合基因SLC45A3-ELK4的組分。上述研究首次建立前列腺癌遺傳風險與表觀轉(zhuǎn)錄組的直接聯(lián)系，提示m6A-QTL可作為中介機制解釋GWAS信號的生物學功能。
圖3：m6A在原發(fā)性前列腺癌中的種系相關(guān)性
缺氧是前列腺癌不良預后的獨立預測因子，研究探究了其對m6A圖譜的系統(tǒng)性影響。通過將m6A Peak豐度與先前計算的缺氧評分進行Spearman相關(guān)分析，鑒定出2,280個缺氧相關(guān)Peak。這些Peak在缺氧腫瘤中豐度普遍降低，且顯著富集于轉(zhuǎn)錄調(diào)控和染色質(zhì)組織相關(guān)基因（圖4a），提示缺氧可能通過m6A介導基因表達變化。m6A患者亞型也與缺氧相關(guān)，其中突變較少的P5簇最常氧（圖4b）。
進一步驗證中，將前列腺癌細胞系V16A和PC-3暴露于缺氧環(huán)境中24小時后行MeRIP-seq，發(fā)現(xiàn)缺氧特異性Peak與患者樣本中的缺氧響應Peak顯著重疊（圖4f-g）。HNRNPLL基因的Peak在三組數(shù)據(jù)中均顯示一致的缺氧負相關(guān)（圖4h），證實其作為缺氧響應表觀轉(zhuǎn)錄標記的準確性。
圖4：腫瘤缺氧與廣泛的m6A調(diào)控相關(guān)
研究系統(tǒng)評估了m6A在預后預測中作為生物標志物的潛力。
首先，m6A調(diào)控基因本身頻繁發(fā)生體細胞變異，大多數(shù)腫瘤都存在影響m6A酶編碼基因突變（圖5a），在包含1,239名患者的六個獨立隊列的薈萃分析中，m6A調(diào)控基因的拷貝數(shù)變異能顯著預測疾病復發(fā)（圖5b）。其中VIRMA（Writer）和YTHDF3（Reader）擴增顯著預測復發(fā)風險降低（圖5b-d）。這種關(guān)聯(lián)可能反映這些基因在特定背景下的抑癌功能。
其次，TP53和NKX3-1等抑癌基因的生存分析顯示，m6A豐度提供了顯著的預后信息（圖5e）。TP53缺失背景下，更高的m6A修飾水平與與復發(fā)風險增加相關(guān)（HR: 3.35）（圖5f-i）；NKX3-1缺失時也觀察到類似趨勢（HR=3.60）。這表明m6A可放大抑癌基因失活的后果。更直接的證據(jù)來自Peak水平分析：在20,334個常見Peak中，INHBA（轉(zhuǎn)化生長因子β家族）、VCAN（細胞外基質(zhì)）和ZFHX4（轉(zhuǎn)錄因子）上的Peak存在顯著預測價值，INHBA、VCAN和ZFHX4轉(zhuǎn)錄本上的特定m6A Peaks與腫瘤復發(fā)強烈相關(guān)（圖5j），其中VCAN Peak存在與與更差的患者結(jié)局相關(guān)（圖5k）。
圖5：m6A位點的生物標志物潛力分析
在功能驗證環(huán)節(jié)，研究聚焦于VCAN這一預后最顯著的m6A靶點。VCAN編碼蛋白聚糖versican，是腫瘤基質(zhì)的關(guān)鍵成分。研究發(fā)現(xiàn)，VCAN m6A Peak陽性腫瘤（~15%）的VCAN mRNA和蛋白豐度均顯著高于陰性腫瘤，且該關(guān)聯(lián)在5個獨立患者隊列（981例）中一致。高VCAN mRNA表達與更差的生存結(jié)局顯著相關(guān)（圖6a-b）。為證實VCAN的功能作用，研究在PC-3細胞系（高內(nèi)源性VCAN m6A）中敲低VCAN，結(jié)果顯示可以顯著抑制細胞增殖、遷移和侵襲能力（圖6c）。體內(nèi)實驗中，VCAN敲低可以顯著降低異種移植瘤的生長（圖6d）和轉(zhuǎn)移過程中的細胞外滲。
在分子機制的探索上，研究人員揭示了m6A如何通過reader蛋白調(diào)控VCAN。使用dCasRx/METTL3系統(tǒng)對VCAN轉(zhuǎn)錄本進行位點特異性m6A添加后，VCAN的m6A修飾水平、mRNA和蛋白質(zhì)豐度均顯著增加（圖6e-f），并增強了PC-3細胞的增殖和遷移（圖6g-h）。RIP-qPCR實驗證實VCAN mRNA是m6A reader蛋白IGF2BP1/2/3的共同靶標（圖6i）。敲低這三個reader蛋白會降低VCAN mRNA和蛋白豐度（圖6j），并抑制細胞增殖和侵襲。
圖6：VCAN在體外和體內(nèi)促進腫瘤增殖和進展
本研究系統(tǒng)繪制了局限性前列腺癌的m6A圖譜，揭示了其與種系遺傳、體細胞突變、腫瘤微環(huán)境（如缺氧）和臨床結(jié)局的復雜關(guān)聯(lián)。研究不僅將m6A確立為一種有前景的生物標志物，更重要的是通過VCAN等案例闡明了m6A通過穩(wěn)定關(guān)鍵癌基因mRNA來促進腫瘤進展的具體分子機制。這為開發(fā)靶向m6A調(diào)控通路或其下游靶點的新型治療策略（如靶向IGF2BPs）提供了理論依據(jù)。
MeRIP-seq技術(shù)是繪制全轉(zhuǎn)錄組m6A修飾圖譜的經(jīng)典方法。在本研究中，它不僅是發(fā)現(xiàn)工具（鑒定出32,051個高置信度m6A peaks），更通過將MeRIP-seq數(shù)據(jù)與基因組（SNP、CNA）、轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）、蛋白質(zhì)組、臨床病理數(shù)據(jù)整合，研究得以從關(guān)聯(lián)走向機制，回答了“m6A在哪里”、“誰調(diào)控它”、“它影響什么”以及“它如何影響疾病”等一系列核心問題，為解析復雜疾病機制提供了方法學思路參考。
參考文獻：
Xu X, …, He HH，et al. The landscape of N6-methyladenosine in localized primary prostate cancer. Nat Genet. 2025 Mar 24.. doi: 10.1038/s41588-025-02128-y.
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