近日，丹麥哥本哈根大學Elisabetta Ferretti團隊以小鼠植入后外胚層（post-implantation epiblast）為模型，深入探究了細胞在響應相同分化信號（如WNT、BMP）時的不同命運（如神經(jīng)外胚層、內(nèi)胚層、中胚層）決定機制。研究利用外胚層干細胞（EpiSCs）體外培養(yǎng)模型，結合基因編輯、轉(zhuǎn)錄組測序、全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）、染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）和染色質(zhì)可及性分析（ATAC-seq）等多組學技術，系統(tǒng)解析了表觀遺傳修飾如何決定外胚層細胞分化命運。相關研究成果以“Cell-context response to germ layer differentiation signals is predetermined by the epigenome in regionalized epiblast populations”發(fā)表在《Nature Communications》期刊。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF/ERK信號通路活性在外胚層細胞中呈現(xiàn)梯度分布，通過調(diào)控DNA甲基化（而非染色質(zhì)可及性）決定了神經(jīng)外胚層、定型內(nèi)胚層（Definitive Endoderm，DE）和神經(jīng)中胚層祖細胞（NMPs）的命運偏倚，這種譜系偏倚在分化之前被“預編程”（primed）。DNA甲基化在WNT信號驅(qū)動下調(diào)控胚層分化，而染色質(zhì)可及性則主要影響B(tài)MP信號介導的胚外中胚層（ExM）命運決定。研究進一步揭示轉(zhuǎn)錄因子PBX1通過調(diào)控ERK活性，進而影響ETS家族轉(zhuǎn)錄因子。PBX1-ERK-ETS軸不依賴于HOX功能，通過調(diào)控Spry2反饋回路，在外胚層期即構建譜系特異性表觀基因組狀態(tài)，從而決定細胞命運。

英文標題：Cell-context response to germ layer differentiation signals is predetermined by the epigenome in regionalized epiblast populations
中文標題：區(qū)域化外胚層細胞群中，細胞對胚層分化信號的差異化響應由表觀基因組預先決定
發(fā)表時間：2025年5月29日
發(fā)表期刊：Nature Communications
影響因子：IF15.7/Q1
技術平臺：WGBS、ChIP-seq、ATAC-seq、scRNA-seq
作者單位：丹麥哥本哈根大學
DOI:10.1038/s41467-025-60348-6

干細胞憑借其分化為多種細胞類型的潛能，在再生醫(yī)學領域展現(xiàn)出廣闊前景。然而，干細胞維持多能性以及其向特定譜系進行命運特化的潛在分子機制仍未完全闡明。本研究利用體內(nèi)外模型，發(fā)現(xiàn)譜系特異性表觀遺傳印記（染色質(zhì)可及性和甲基化狀態(tài)）先于胚層分化程序轉(zhuǎn)錄激活，且主要通過DNA甲基化影響神經(jīng)外胚層、定型內(nèi)胚層（DE）和神經(jīng)中胚層譜系命運決定�？傊�，本研究證明表觀遺傳機制可精細調(diào)控外胚層多能性，使其能夠?qū)Πl(fā)育譜系進行時空特異性響應。

研究方法
細胞模型：
使用小鼠外胚層干細胞（EpiSCs）作為植入后外胚層的體外模型。通過流式細胞術（FACS）分選出CLDN6High和CLDN6Low兩個亞群進行研究。

遺傳與藥理學模型：
構建Pbx1基因敲除（KO）的EpiSCs細胞系，用于研究PBX1功能。
使用ERK通路抑制劑（PD0325901,PD03）處理細胞，模擬低ERK活性狀態(tài)。

多組學綜合分析：

• RNA-seq：分析CLDN6High/Low EpiSCs、Pbx1KO EpiSCs及其分化后細胞轉(zhuǎn)錄組差異。
• ATAC-seq：在全基因組范圍內(nèi)檢測染色質(zhì)開放區(qū)域，揭示染色質(zhì)可及性狀態(tài)差異。
• 全基因組甲基化測序（WGBS）：在全基因組單堿基分辨率水平檢測DNA甲基化（5mC）模式，揭示DNA甲基化如何預先決定細胞命運。
• ChIP-seq：在全基因組范圍內(nèi)鑒定PBX1蛋白的DNA結合位點，研究其直接調(diào)控的靶基因。

功能與表型分析：

• 免疫熒光（IF）與成像：對胚胎和細胞進行染色，觀察譜系標記物表達和組織形態(tài)。
• 流式細胞術與分選：基于CLDN6表達進行細胞分選和表型分析。
• 電泳遷移率變動分析（EMSA）：驗證PBX1蛋白與Spry2基因調(diào)控區(qū)域的直接結合。
• 蛋白互作網(wǎng)絡分析（STRING）：構建并分析ERK/ETS與表觀遺傳調(diào)控蛋白之間的互作網(wǎng)絡。

圖1：具有前部和遠端后部外胚層特性的區(qū)域化外胚層干細胞中的FGF/ERK差異性活性

圖2：CLDN6Low和CLDN6High外胚層干細胞具有顯著胚層分化偏倚差異

（3）外胚層DNA甲基化預先決定WNT驅(qū)動的胚層命運
為探究表觀遺傳機制，研究者首先對CLDN6分選細胞進行ATAC-seq分析。出乎意料的是，在WNT抑制狀態(tài)下，CLDN6High與CLDN6Low EpiSCs之間僅鑒定出110個差異可及性peaks（DAPs），且無任何DAPs與胚層譜系基因直接相關（圖3a）。這一結果與之前報道的WNT信號驅(qū)動染色質(zhì)異質(zhì)性結論相悖，提示在EpiSCs維持條件下，染色質(zhì)可及性并非命運偏向的主要決定因子。但WNT刺激后，CLDN6Low APSD中NMPs特異性順式調(diào)控元件（CREs）可及性顯著增加，伴隨WNT效應因子LEF1結合增強（圖3b），表明染色質(zhì)重塑是WNT響應的下游事件而非預編程機制。

WGBS分析揭示決定性差異。盡管整體CpG甲基化水平無顯著差異（~70%），CLDN6Low EpiSCs的內(nèi)含子區(qū)域甲基化程度顯著高于CLDN6High細胞（圖3c-d）。更關鍵的是，差異甲基化基因（DMGs）分析發(fā)現(xiàn)，CLDN6Low與CLDN6High EpiSCs中，DE譜系基因（Foxa2, Gata6, Sox17）和神經(jīng)外胚層基因（Pax6, Onecut1/2, Lmx1a, Dbx1）表現(xiàn)出高甲基化，而NMPs相關基因則無差異甲基化（圖3e）。

以Pax6為例，其CRE區(qū)域在CLDN6High EpiSCs中特異低甲基化，與后續(xù)神經(jīng)分化中Pax6表達上調(diào)相關（圖3f），但ATAC-seq顯示該CRE在兩組EpiSCs中可及性類似，證明DNA甲基化狀態(tài)先于染色質(zhì)開放狀態(tài)決定譜系功能。WNT誘導的CLDN6Low APSD分化伴隨Pax6等區(qū)域甲基化水平下降（圖3d），而CLDN6High APSD中DE基因甲基化狀態(tài)保持穩(wěn)定。

上述研究結果表明，DNA甲基化預先決定WNT響應機制，遠端后部外胚層（CLDN6Low）通過高甲基化鎖定DE和前神經(jīng)命運，介導WNT信號驅(qū)動NMPs形成；而前部外胚層（CLDN6High）甲基化狀態(tài)允許WNT誘導DE分化（圖3g）。

圖3：外胚層甲基化組預先決定胚層分化過程中細胞的WNT響應

1. ATAC-seq數(shù)據(jù)火山圖顯示與CLDN6Low外胚層干細胞相比，CLDN6High外胚層干細胞中有110個唯一差異可及性峰（DAPs）。
2. CLDN6Low和CLDN6High外胚層干細胞及APSD在神經(jīng)（前部和后部）與體節(jié)前中胚層（PSM）假定順式調(diào)控元件（CREs）上的染色質(zhì)可及性位點的平均密度圖（上圖）和熱圖（下圖）。
3. 豆莢圖顯示CLDN6Low和CLDN6High外胚層干細胞及APSD中基因±5 kb的CpG甲基化水平相似。
4. 星戰(zhàn)圖顯示內(nèi)含子CpG甲基化水平，CLDN6Low外胚層干細胞中最高，CLDN6High APSD中最低。CLDN6High外胚層干細胞與APSD水平相似。
5. 圓形代表CLDN6Low和CLDN6High外胚層干細胞各個細胞類型中的所有基因。重疊區(qū)域顯示這兩種細胞類型之間的差異甲基化基因（DMGs），包括高甲基化和低甲基化基因。CLDN6Low和CLDN6High外胚層干細胞具有與定型內(nèi)胚層DE（Foxa2, Sox17, Gsc, Gata6）、神經(jīng)外胚層（Pax6, Onecut1, Onecut2, Lmx1a, Dbx1）譜系相關的DMGs，但無神經(jīng)中胚層祖細胞NMPs相關基因。
6. Pax6基因組區(qū)域的WGBS可視化顯示CLDN6High外胚層干細胞中特異高甲基化區(qū)域（紅色箭頭），相較CLDN6Low外胚層干細胞（白色箭頭），位置和功能與先前研究PAX6 CRE41相似。
7. 模式圖展示DNA甲基化如何預先設定植入后外胚層細胞對WNT依賴性和非依賴性譜系命運的響應。

圖4：PBX1調(diào)控外胚層干細胞中的ERK水平與表觀遺傳機制。

1. 對植入后E5.5胚胎進行的共聚焦免疫熒光分析，顯示PBX1在外胚層（Ep）中表達，而在原始內(nèi)胚層（PrEnd）中不表達。
2. 野生型（WT）與Pbx1敲除（Pbx1KO）外胚層干細胞中差異表達基因的熱圖，揭示了FGF/ERK信號通路組分的差異。
3. Western blot證實PBX1敲除外胚層干細胞中PBX1缺失和磷酸化ERK1/2（pERK1/2）水平降低。
4. 染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)火山圖顯示Pbx1敲除外胚層干細胞中的576個差異可及性峰（DAPs），并顯示BMP響應基因（Hand1, E2f4, Col26a1, Bmp3, Egr3, Itga4）富集。
5. 野生型與Pbx1敲除外胚層干細胞input DAPs的de novo motif分析餅圖，揭示ETS結合位點富集。
6. 野生型相對于Pbx1敲除外胚層干細胞的576個DAPs富集ETS轉(zhuǎn)錄因子motif。
7. 各細胞類型（野生型和Pbx1敲除型）圓圈圖。重疊區(qū)域?qū)�應差異甲基化基因（DMGs）。
8. STRING蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡分析顯示ERK/ETS蛋白與表觀遺傳機制之間的互作。
9. PBX1負調(diào)控ERK反饋環(huán)路從而調(diào)節(jié)ERK信號活性機制示意圖。

圖5：ERK缺失型Pbx1敲除外胚層干細胞在分化相關的胚外中胚層缺失出現(xiàn)前，已在胚外中胚層譜系基因上表現(xiàn)出特異性染色質(zhì)和DNA甲基化譜。

1. 受BMP信號影響的E7.5時期胚外中胚層譜系：尿囊、羊膜和卵黃囊。
2. E7.5對照組和Pbx1f/f;Pbx2;Sox2-/-Cre/+胚胎的共聚焦三維投影圖。
3. 野生型和Pbx1敲除外胚層干細胞向PPS和ExM細胞分化實驗方案示意圖。
4. 不同階段（黃色:外胚層干細胞，灰色:PPS，紅色:ExM）的譜系特異性差異表達基因（DEDG）熱圖。
5. Pbx1敲除外胚層干細胞在進行胚外中胚層分化時，表現(xiàn)出向原始紅細胞和卵黃囊間充質(zhì)分化偏好。
6. 野生型與Pbx1敲除外胚層干細胞中的差異甲基化基因（DMGs）及其在PPS和ExM分化過程中的轉(zhuǎn)錄變化示意圖。
7. WGBS可視化圖，顯示野生型和Pbx1敲除外胚層干細胞中Hand1位點差異甲基化區(qū)域，表明Pbx1敲除細胞中存在高甲基化。條形圖顯示CpG甲基化水平。
8. Hand1位點的UCSC基因組瀏覽器視圖，顯示在野生型條件下染色質(zhì)可及性增加，而在Pbx1敲除細胞中該位點保持關閉狀態(tài)。
9. WGBS軌跡圖，顯示野生型和Pbx1敲除外胚層干細胞中Tbx3位點的CpG甲基化水平，表明野生型外胚層干細胞中存在高甲基化。底部條形圖描繪CpG甲基化水平。
10. Tbx3位點ATAC-seq軌跡圖顯示Pbx1敲除細胞與野生型細胞相比，染色質(zhì)可及性增加。