一、染色質(zhì)重塑復(fù)合物識(shí)別與滑動(dòng)六聚體核小體的結(jié)構(gòu)機(jī)制解析
在真核細(xì)胞中，基因組DNA纏繞于組蛋白八聚體形成核小體，此結(jié)構(gòu)是維持染色質(zhì)高級(jí)構(gòu)象及調(diào)控基因表達(dá)的核心基礎(chǔ)。經(jīng)典核小體由約147 bp的DNA片段與一個(gè)組蛋白八聚體（包含兩個(gè)H2A-H2B二聚體及一個(gè)H3-H4四聚體）組裝而成。然而，在動(dòng)態(tài)的細(xì)胞環(huán)境中，核小體組成并非恒定。諸如DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及染色質(zhì)重塑等多種生物學(xué)過程可導(dǎo)致其組蛋白組成與DNA包裹方式發(fā)生改變，從而形成各類非經(jīng)典核小體。

其中，六聚體核小體是研究較為深入的非經(jīng)典形式之一。其結(jié)構(gòu)僅包含一個(gè)H2A-H2B二聚體與一個(gè)H3-H4四聚體，所結(jié)合的DNA長(zhǎng)度相應(yīng)縮短至約110 bp。該結(jié)構(gòu)早期即被發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)：1983年，Daniela Rhodes團(tuán)隊(duì)的研究表明六聚體核小體可與RNA聚合酶II結(jié)合，提示其在活躍轉(zhuǎn)錄染色質(zhì)區(qū)域存在。2022年，Geeta Narlikar實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，六聚體核小體可作為底物被酵母源的染色質(zhì)重塑復(fù)合物INO80所識(shí)別并驅(qū)動(dòng)其滑動(dòng)，這引發(fā)了領(lǐng)域內(nèi)對(duì)其特異性識(shí)別與重塑機(jī)制的深入關(guān)注。

2023年6月29日，歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室Sebastian Eustermann課題組的張敏博士等在《Science》上發(fā)表了題為“Hexasome-INO80 complex reveals structural basis of non-canonical nucleosome remodeling”的研究論文。該研究首次解析了染色質(zhì)重塑復(fù)合物INO80與六聚體核小體形成功能復(fù)合物的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，從根本上揭示了INO80復(fù)合物特異性識(shí)別、結(jié)合并驅(qū)動(dòng)此類非經(jīng)典核小體進(jìn)行空間重排的分子機(jī)理。這一結(jié)構(gòu)生物學(xué)突破，為理解六聚體核小體在基因組內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色質(zhì)可塑性維持及相關(guān)細(xì)胞過程的分子基礎(chǔ)提供了關(guān)鍵框架。

二、INO80復(fù)合物與六聚體核小體結(jié)合的結(jié)構(gòu)特征
INO80復(fù)合物通常由15個(gè)亞基組成，按其功能可劃分為三個(gè)主要模塊：含有Ino80 ATP水解酶的催化核心模塊（core module）、包含核內(nèi)肌動(dòng)蛋白的Arp8模塊（Arp8 module），以及物種特異的Nhp10模塊（Nhp10 module）。其中，Nhp10模塊對(duì)于復(fù)合物的核小體滑動(dòng)活性并非必需（圖1）。本研究采用重組表達(dá)技術(shù)，獲得了嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum）來(lái)源的INO80催化核心模塊與Arp8模塊，并在非交聯(lián)條件下將其與六聚體核小體組裝成復(fù)合物。通過單顆粒冷凍電鏡技術(shù)，成功解析了該復(fù)合物在活性狀態(tài)下的兩種構(gòu)象，其局部分辨率介于2.9至5.7 Å之間。

圖1 INO80催化核心模塊與六聚體核小體的總體結(jié)構(gòu)

結(jié)構(gòu)分析表明，INO80的催化核心模塊主要與六聚體核小體的核心區(qū)域（即組蛋白六聚體及其所纏繞的DNA）結(jié)合（圖1），而Arp8模塊則特異性地結(jié)合于核小體間裸露的連接DNA（linker DNA）（圖3，詳見下文）。與此前解析的INO80與經(jīng)典核小體的結(jié)合結(jié)構(gòu)相比【5, 6】，其催化核心模塊的自身構(gòu)象未見顯著改變；然而，該模塊與六聚體核小體的結(jié)合模式卻展現(xiàn)出根本性差異。INO80并非通過傳統(tǒng)的酸性補(bǔ)�。╝cidic patch）介導(dǎo)相互作用，而是選擇性地結(jié)合在六聚體核小體上因缺失一個(gè)H2A-H2B二聚體而暴露出的蛋白表面。與此同時(shí)，六聚體核小體中僅存的單一H2A-H2B二聚體則朝向相反方向，完全暴露于溶劑之中（圖1）。這一顛覆性的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，后續(xù)也得到了生化實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證支持（圖2）。

圖2 非酸性補(bǔ)丁依賴的INO80-六聚體核小體識(shí)別機(jī)制  

此外，相較于其在經(jīng)典核小體上的定位，INO80復(fù)合物整體發(fā)生了約145°的中心旋轉(zhuǎn)（spin-rotation）。這一顯著的構(gòu)象重排導(dǎo)致其馬達(dá)亞基（Ino80 ATPase motor）結(jié)合位點(diǎn)從經(jīng)典核小體上的SHL-6位置，轉(zhuǎn)移至六聚體核小體DNA的SHL-3位置。值得注意的是，經(jīng)典的SHL-6位點(diǎn)由于對(duì)應(yīng)區(qū)域H2A-H2B二聚體的缺失，在六聚體核小體上已轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢畏抢p繞DNA（unwrapped DNA）區(qū)域（圖1）。這些結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)共同揭示了INO80復(fù)合物特異性識(shí)別并適應(yīng)非經(jīng)典核小體底物的獨(dú)特分子機(jī)制。

已有研究指出，INO80復(fù)合物對(duì)經(jīng)典核小體的滑動(dòng)活性，高度依賴于其Arp5亞基與組蛋白H2A-H2B上酸性補(bǔ)�。╝cidic patch）的相互作用【4,6】。在經(jīng)典核小體結(jié)構(gòu)中，Arp5亞基通過其“heel”和“foot”亞結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合至酸性補(bǔ)丁的酸性殘基；針對(duì)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵殘基進(jìn)行突變后，INO80的核小體滑動(dòng)活性顯著降低（圖2）。然而，在六聚體核小體結(jié)構(gòu)中，伴隨一個(gè)H2A-H2B二聚體的缺失以及INO80整體發(fā)生約145°的中心旋轉(zhuǎn)（spin-rotation），Arp5的“heel”與“foot”亞結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)而與組蛋白H3-H4的表面區(qū)域接觸。這一結(jié)構(gòu)重塑解釋了INO80在六聚體核小體上的滑動(dòng)為何不依賴于經(jīng)典的酸性補(bǔ)丁機(jī)制。

值得注意的是，與在經(jīng)典核小體上的表現(xiàn)相反，Arp5“heel”和“foot”突變體在六聚體核小體上的滑動(dòng)活性相較于野生型INO80反而呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)。這一對(duì)比性發(fā)現(xiàn)表明，Arp5亞基在INO80復(fù)合物對(duì)核小體與六聚體核小體的滑動(dòng)過程中，可能發(fā)揮著截然不同的調(diào)控作用。

三、Arp8模塊作為連接DNA感應(yīng)器的結(jié)構(gòu)證據(jù)
由于INO80催化核心模塊與Arp8模塊之間存在顯著的構(gòu)象柔性，難以在單顆粒重構(gòu)中將其作為整體進(jìn)行處理。因此，本研究對(duì)Arp8模塊進(jìn)行了獨(dú)立的顆粒挑取與三維重構(gòu)分析。重構(gòu)結(jié)果明確顯示，Arp8模塊直接結(jié)合于一段長(zhǎng)約35 bp的裸露DNA片段。

為進(jìn)一步解析兩個(gè)模塊之間的空間組織關(guān)系，研究者對(duì)參與上述重構(gòu)的全部顆粒進(jìn)行了單顆粒水平上的距離分布統(tǒng)計(jì)。分析結(jié)果表明，催化核心模塊與Arp8模塊平均相距約170 Å，并由一段長(zhǎng)度約20 bp的DNA片段相連接（圖3）。值得注意的是，通過對(duì)這些相距約170 Å的顆粒對(duì)進(jìn)行整體重提取和二維分類，獲得了同時(shí)包含催化核心模塊與Arp8模塊的二維類別圖像（圖3）。這一結(jié)果直接證實(shí)，在六聚體核小體復(fù)合物中，Arp8模塊仍保持其作為“連接DNA感應(yīng)器”的分子功能，通過識(shí)別并結(jié)合核小體間的連接DNA，參與調(diào)控復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與活性。

圖3 Arp8模塊與連接DNA的結(jié)構(gòu)及其與催化核心模塊的空間聯(lián)系    

四、INO80的底物識(shí)別機(jī)制及其在染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)中的功能意義
綜上所述，INO80復(fù)合物通過“中心旋轉(zhuǎn)”機(jī)制及其對(duì)不同組蛋白表面的適應(yīng)性識(shí)別，獲得了對(duì)經(jīng)典核小體與非經(jīng)典核小體的雙重滑動(dòng)活性。這種靈活的底物選擇性對(duì)其在復(fù)雜染色質(zhì)環(huán)境中發(fā)揮功能至關(guān)重要，并為理解染色質(zhì)動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)的形成機(jī)制提供了新的視角。在活躍轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)域，六聚體核小體的形成往往伴隨連接DNA長(zhǎng)度的增加，進(jìn)而可能通過招募INO80參與該區(qū)域的核小體定位與分布調(diào)控（圖4）。

圖4 轉(zhuǎn)錄延伸過程中六聚體核小體的滑動(dòng)模式圖  

本研究系統(tǒng)揭示了INO80復(fù)合物識(shí)別與滑動(dòng)六聚體核小體的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，為深入探索非經(jīng)典核小體如何協(xié)同組蛋白修飾、組蛋白變體等表觀遺傳因素參與基因表達(dá)調(diào)控奠定了重要基礎(chǔ)。同時(shí)，該研究也為進(jìn)一步闡明非經(jīng)典核小體與其他染色質(zhì)重塑復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄機(jī)器及組蛋白伴侶等因子在染色質(zhì)層面的協(xié)同互作機(jī)制提供了關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)依據(jù)。

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