串聯(lián)重復(fù)序列作為基因組中動(dòng)態(tài)變化的區(qū)域，不僅是遺傳多樣性的來源，也可能成為疾病的起點(diǎn)。當(dāng)重復(fù)單元不斷擴(kuò)展并超越臨界長(zhǎng)度，便可能引發(fā)亨廷頓舞蹈癥、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)等一系列神經(jīng)系統(tǒng)疾病。然而，傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)受限于讀長(zhǎng)與分辨率，往往難以實(shí)現(xiàn)全面、精準(zhǔn)的基因分型。如今，PacBio 基于 HiFi 長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序與 CRISPR 靶向富集技術(shù)推出 PureTarget 重復(fù)序列檢測(cè)解決方案，實(shí)現(xiàn)在單次檢測(cè)中同步解析38個(gè)富含串聯(lián)重復(fù)序列的神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)基因的重復(fù)長(zhǎng)度、序列結(jié)構(gòu)與甲基化狀態(tài)，為這類疾病的研究打開了全新的視野。

01 PureTarget重復(fù)序列檢測(cè)產(chǎn)品參數(shù)

PureTarget repeat expansion panel 2.0包含38個(gè)重復(fù)序列基因位點(diǎn)，在HiFi測(cè)序和串聯(lián)重復(fù)基因分型工具（TRGT）卓越準(zhǔn)確性的支持下，為38種與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的重要基因提供了綜合分析。

表1. PureTarget repeat expansion panel 2.0包含38個(gè)基因靶標(biāo)，在1.0版本基礎(chǔ)上新增加的靶標(biāo)以藍(lán)色突出顯示。

02 PureTarget重復(fù)序列檢測(cè)產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

同步檢測(cè)甲基化信息

甲基化信息在文庫(kù)分子中得以保留，并可在后續(xù)測(cè)序中同步檢測(cè)甲基化信號(hào)。

更好的覆蓋度

捕獲片段的大小偏差更小，使得擴(kuò)展的重復(fù)序列等位基因覆蓋度更好，并可覆蓋高GC%區(qū)域。

更高的準(zhǔn)確性

PureTarget重復(fù)序列檢測(cè)采用基于CRISPR-Cas9的靶向富集技術(shù)，避免了因 PCR擴(kuò)增而產(chǎn)生的復(fù)制錯(cuò)誤，結(jié)合HiFi測(cè)序可實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的重復(fù)序列檢測(cè)。

03 PureTarget重復(fù)序列檢測(cè)產(chǎn)品技術(shù)原理與流程

PureTarget重復(fù)序列檢測(cè)采用CRISPR-Cas9的靶向富集技術(shù)，以高分子量（HMW）DNA作為起始樣本，使用Cas9核酸酶和guide RNA的復(fù)合物在目標(biāo)重復(fù)區(qū)域的上游和下游精確切割位點(diǎn)處切割DNA。隨后通過末端加A尾和barcoded SMRTbell adapter接頭連接形成SMRTbell文庫(kù)分子。對(duì)于正常等位基因，序列的長(zhǎng)度為4-5 kb，但擴(kuò)展的重復(fù)序列等位基因reads可能更長(zhǎng)。對(duì)具有長(zhǎng)重復(fù)序列區(qū)域樣品進(jìn)行測(cè)序表明，在單個(gè)read中可實(shí)現(xiàn)跨越長(zhǎng)度高達(dá)35kb的重復(fù)序列區(qū)域檢測(cè)。

圖1. 基于CRISPR-Cas9靶向富集的PureTarget方法建庫(kù)流程

04 PureTarget重復(fù)序列檢測(cè)產(chǎn)品數(shù)據(jù)表現(xiàn)

PureTarget文庫(kù)測(cè)序產(chǎn)出的HiFi數(shù)據(jù)可以使用串聯(lián)重復(fù)基因分型工具（TRGT）進(jìn)行分析，以提供更全面的基因分型，結(jié)果展示如下：兩個(gè)等位基因的精確大小，包括較長(zhǎng)的擴(kuò)展重復(fù)序列（圖2左）；甲基化的同步解析（圖2右）；重復(fù)序列的單堿基分辨率檢測(cè)（圖3）；深度覆蓋檢測(cè)到的嵌合情況（圖4）。

圖2. 左圖展示的為具有2950個(gè)重復(fù)基序（8850 bp）的擴(kuò)展DMPK等位基因的準(zhǔn)確大小；右圖展示了FMR1的圖譜顯示女性攜帶者（NA07537）中擴(kuò)展等位基因的甲基化一致性

圖3. 左圖展示了復(fù)合RFC1的單堿基分辨率檢測(cè)，包含致病性“AAGGG”重復(fù)基序；右圖展示了FMR1重復(fù)序列中的AGG插入序列

圖4. 深度覆蓋捕獲樣本內(nèi)C9orf72重復(fù)序列長(zhǎng)度分布

訂購(gòu)信息

PureTarget重復(fù)序列檢測(cè)解決方案推薦使用Nanobind提取試劑盒進(jìn)行HMW DNA樣本提取，支持人類血液和細(xì)胞等樣品類型。建庫(kù)流程使用PureTarget repeat expansion panel 2.0與手動(dòng)或自動(dòng)PureTarget Kit搭配使用，同時(shí)需要結(jié)合Barcoded adapters（SMRTbell adapter index plate 96A-D）接頭以支持后續(xù)多樣本混樣測(cè)序。對(duì)于手動(dòng)和自動(dòng)化文庫(kù)制備，測(cè)序前均需使用PureTarget cleanup Kit對(duì)混樣文庫(kù)進(jìn)行最終清洗。相關(guān)試劑盒詳細(xì)信息參見下表。

表2. PureTarget重復(fù)序列檢測(cè)建庫(kù)試劑盒概覽

當(dāng)技術(shù)的邊界不斷拓展，我們對(duì)生命的理解也隨之深化。PacBio PureTarget 重復(fù)序列檢測(cè)融合了長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序與靶向富集技術(shù)，一次性解析38個(gè)疾病靶標(biāo)基因的長(zhǎng)度、序列與甲基化狀態(tài)，為神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病研究提供了高效可靠的解決方案，不僅加速了致病機(jī)制的解析，也為臨床診斷與罕見病研究開辟了更清晰的路徑。

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