實驗內(nèi)容與方法（以 hESC H1 及 6 孔板 1 個孔為例）

一、試劑準備
各階段培養(yǎng)基成分

(1）在 4℃解凍 補充劑 A、B、C、D、E，不要在 37℃條件下解凍。
(2)  在生物安全柜中，參考表 1 及表 3，按照比例使用無菌移液管及槍頭混勻配制成分化各階段培養(yǎng)基 。例如 mNPC 誘導培養(yǎng)基（0-2）組成為基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1、1×濃度的補充劑 A、B，若用量為 10mL，配制方法為 8.8 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1+200μL 補充劑 A（50×）+1 mL 補充劑 B（10×）。
(3) 分化培養(yǎng)基建議現(xiàn)配現(xiàn)用，置于 4℃儲存，2 周內(nèi)使用。

注：補充劑 B 使用時盡量避光，且所有補充劑可根據(jù)使用量進行分裝以避免反復凍融。

二、hESC 培養(yǎng)和準備（詳見Advance 人多能干細胞培養(yǎng)基使用說明書）

三、DAY 0-9: hESC 分化為中腦神經(jīng)祖細胞（mNPC）
(1) 包被液 1 和 2 在 4℃下解凍，與 DMEM/F12 均勻混合，按 2 U/cm2的包被密度鋪板，備用。
(2) DAY 0：當hESC的匯合度達到75%-85%，吸去培養(yǎng)基，用2mL 1x室溫PBS（不含Ca 2+ /Mg 2+ )清洗 hESC，吸去 PBS。
(3) 加入 1mL 含 Y-27632（10 μM）的室溫 Accutase，轉(zhuǎn)移到 37℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中3-5min，使其解離成單細胞。
(4) 3-5min 后，將干細胞傳代培養(yǎng)基以等體積直接加入 Accutase 中，并使用 P-1000 吸頭輕輕上下吹打細胞，制成單細胞懸液，將細胞單懸液收集到 15mL 離心管中，室溫下 300 g 離心 5 min。
(5) 從包被液 1 包被的板中小心地抽吸包被液而不損壞涂層表面。
(6) 離心結(jié)束，充分去除上清，將 1 mL 預(yù)熱的 mNPC 誘導培養(yǎng)基（0-2）（成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1，1×補充劑 A，1×補充劑 B）（含 10μM Y-27632）重懸細胞，輕輕地上下移液以確保單細胞溶液均勻。
(7) 使用自動細胞計數(shù)器計數(shù)細胞，使用臺盼藍排除死亡細胞，將細胞接種到步驟 1 制備的包被板上使得最終密度為 6.0 -8.0×104個細胞/cm2，在 6 孔板中每孔最終體積為 2 mL（含 10μM Y-27632），將孔板轉(zhuǎn)移到 37℃、5%CO2 細胞培養(yǎng)箱中孵育 48 h（若 24 h 后培養(yǎng)基變黃則及時用含 10μM Y-27632 的 mNPC 誘導培養(yǎng)基換液(0-2)）。
(8) DAY 2：使用 mNPC 誘導培養(yǎng)基（2-7）換液（成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1，1×補充劑 A，1×補充劑 C），直到第 7 天。
(9) DAY 7：使用 mNPC 誘導培養(yǎng)基（7-9）換液（成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1，1×補充劑 A，1×補充劑 D），培養(yǎng)至第 9 天�？扇〉� 9 天的細胞進行免疫熒光染色檢測 NPC 標志物如 SOX2、Nestin，中腦標志物 FOXA2。

注：包被液使用時需在冰上操作，所有與包被液直接接觸的物品需提前預(yù)冷。包被液鋪板后盡量于 1 周內(nèi)使用,使用前需至于室溫 1h 或 37℃培養(yǎng)箱孵育 30 分鐘以上，以恢復至室溫。

四、DAY 9-23: mNPC 誘導分化為中腦多巴胺神經(jīng)元(mDA)
(1) DAY 9： 第 9 天，從培養(yǎng)物中抽吸培養(yǎng)基，在 6 孔板中每孔用 2 mL 1×室溫 PBS（不含Ca2+/Mg2+)清洗培養(yǎng)物，然后從孔中移除 PBS。
(2) 加入 1mL 含 Y-27632（10 μM）的室溫 Accutase，轉(zhuǎn)移到 37℃ 5% CO2 細胞培養(yǎng)箱中3-5min，使其解離成單細胞。
(3) 3-5min 后，將 DMEM/F12（含 10μM Y-27632）以等體積直接加入 Accutase 中，并使用P-1000 吸頭輕輕上下吹打細胞，制成單細胞懸液，將細胞單懸液收集到 15mL 離心管中，室溫下 300 g 離心 5 min。
(4) 從包被液 1 包被的板中小心地抽吸包被液而不損壞涂層表面。
(5) 離心結(jié)束，充分去除上清，將適量預(yù)熱的 mDA 誘導培養(yǎng)基（成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1，1 ×補充劑 A）（含 10μM Y-27632）重懸細胞，輕輕地上下移液以確保單細胞溶液均勻。按 1:3 比例接種在包被液 1 包被的板中，每孔加入 2 mL 細胞懸液于 37℃、5%CO2 細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h 。
(6) DAY 11: 第 11 天開始根據(jù)培養(yǎng)基顏色每天或隔天更換一次 mDA 誘導培養(yǎng)基，直到第 23 天。

注：D23 天的 mDA 可用無血清細胞凍存液plus（abs9478）在液氮中冷凍。

五、DAY 23-40: mDA 成熟階段
(1) DAY 23: 第 23 天，從培養(yǎng)物中抽吸培養(yǎng)基，在 6 孔板中每孔用 2 mL1×室溫 PBS（不含 Ca2+/Mg2+)清洗培養(yǎng)物，吸去 PBS。
(2) 每孔加入 1mL 含 Y-27632（10 μM）的室溫 Accutase，將培養(yǎng)物置于 37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育 5 min。
(3) 5min 后每孔加入 1mL DMEM/F12（含 10μM Y-27632），輕輕吹打細胞，使其脫離孔底。
(4) 將細胞懸液收集到 15 mL 離心管中，室溫下 300 g 離心 5 min。
(5) 仔細抽吸上清液，不干擾細胞，用 1mL 恢復室溫的 mDA 成熟培養(yǎng)基（成分為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 2，1×補充劑 E）（含 10μM Y-27632）重懸細胞，輕輕地上下移液以確保單細胞溶液均勻。
(6) 使用臺盼藍排除死亡細胞，自動細胞計數(shù)器計數(shù)細胞，將細胞接種到提前制備的包被液 2 包被的 6 孔板上使得密度為 6-8×10^5個細胞/cm2 ，根據(jù)培養(yǎng)基顏色每天或隔天換液，直到第 25 天。
(7) DAY 25: 更換為不含 Y-27632 的 mDA 成熟培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基顏色每天或隔天換液，直到第 40 天。
(8) 第 40 天可檢測到神經(jīng)元標志物（MAP2），多巴胺神經(jīng)元標志物（TH、DAT、GIRK2）的表達。

注：由于細胞密度較高，注意及時換液。

產(chǎn)品信息表

1、試劑盒組成信息

注：括號內(nèi)容如50×為母液濃度，使用時終濃度需為1×。例如補充劑A（50×）和補充劑B（10×）需添加進基礎(chǔ)培養(yǎng)基1使其分別稀釋50倍以及10倍，使得補充劑終濃度為1×，配成mNPC誘導培養(yǎng)基（0-2）。

包被液1濃度250U/mL表示每毫升有250個單位的包被蛋白，在本方案中鋪板時，每平方厘米需要2個單位的包被蛋白。

2、輔助試劑

3、輔助耗材

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