樣本制備全流程之磁珠分選得率純度提升核心技巧
目的細胞的純度與得率，是 “樣本制備” 與 “細胞分選” 兩大環(huán)節(jié)緊密銜接、共同作用的結果。
樣本制備是分選的 “源頭地基”：從組織保存、解離到預分選處理，每一步都為后續(xù)分選奠定基礎；而細胞分選本身，也需系統(tǒng)兼顧分選前準備、過程操作與分選后處理的全程細節(jié)。只有兩端同時優(yōu)化，才能實現(xiàn)高純度、高得率的穩(wěn)定結果。本期我們將聚焦樣本制備全流程，拆解易被忽略的重要操作細節(jié)，助您從源頭提升分選效能，攻克實驗痛點! （分為上下兩篇噢）
樣本保存
單細胞懸液制備過程中，樣本獲取后若無法及時處理或需短途運輸，需進行特殊保存處理，否則會影響細胞狀態(tài)進而直接影響細胞活率，導致后續(xù)分選實驗的得率和純度下降。樣本保存特殊處理建議如下：
組織樣本
組織樣本通常指非液體組織來源，可用商品化組織保存液保存，將組織完全浸于保存液中，4℃保存或運輸，可保證至少48h內細胞活性無改變，極大降低細胞凋亡或死亡。
重要操作Tips：
（1）根據(jù)組織塊大小選擇對應體積離心管，保證組織與保存液充分接觸，避免管體過大導致保存液浪費，過小則組織無法完全浸沒，局部細胞易干燥壞死。
（2）組織無需剪切，直接放入保存液中，否則會破壞細胞間連接，增加解離難度。
| 貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 保存時間 |
| 130-100-008 | MACS Tissue Storage Solution | 100ml | 2-8℃，保持新鮮樣本活性 48h |
| 130-129-552 | MACS® Freezing Solution | 50ml | 2-8℃，保持樣本活性 72h |
| 570911 | OMICS-Guard Sample Preservation Buffer | 50ml | 2-8℃，保持樣本活性 72h |
| 570908 | BD Rhapsody cDNA Kit | 12×1ml | 2-8℃，保持樣本活性 72h |
| abs9474 | 組織保存液 | 100ml | 2-8℃，保持樣本活性 72h |
血液樣本
血液樣本可使用含特定抗凝劑如肝素鈉（abs47014863）等抗凝管保存，可保證至少24小時內細胞活性與免疫學特性穩(wěn)定，有效避免細胞死亡及活力下降。
重要操作Tips：
（1）使用抗凝管收集血液樣本后應立即輕柔顛倒抗凝管5-8 次，使抗凝劑與血液充分接觸，避免劇烈震蕩，否則會導致溶血。
（2）不同類型抗凝管保存時間有所不同，需根據(jù)實驗需求進行選擇。如無法在規(guī)定時間內完成單細胞懸液制備，可將目標細胞分離出來，使用細胞凍存液程序性降溫后進行長期凍存。
（3）血液樣本收集完成后，應在室溫下直立保存運輸，且需及時檢測樣本質量，避免因樣本降解、細胞損傷影響后續(xù)分選結果，同時需嚴格排查微生物污染，防止污染導致實驗失敗或數(shù)據(jù)偏差。
制備單細胞懸液
單細胞懸液的質量是細胞分選成敗的關鍵，其制備的核心在于 “避免細胞過度解離” 與 “最大化保留細胞數(shù)量”之間的精準平衡。針對不同來源的樣本，為您推薦如下解離方案：
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實體組織樣本
- 機械法：通過物理作用，如研磨、過濾、吹打，分解質地較軟或纖維含量少的組織樣本。此方法操作簡單、快速，成本低，但易造成組織細胞損傷，細胞分散不完全，解離效果較一般。
- 機械法操作tips：
- 組織樣本應在冰浴或4℃解離，研磨緩沖液提前預冷，減少細胞代謝消耗和熱損傷。
- 研磨時輕柔按壓，不要過多研磨或用針頭或細口徑吸管強行吹打同一組織樣本，反復操作會損傷細胞。
- 應根據(jù)目的細胞大小選擇合適參數(shù)的細胞篩網(wǎng)（30/70/100μm）過濾。
- 酶解法：通過消化酶，如膠原酶、胰蛋白酶等，分解如腫瘤、肝臟、腎臟等纖維含量高或質地堅韌的組織。此方法能保持細胞完整性和活性，可選擇酶種類豐富多樣，但操作較繁瑣，消化時間長且難控制，可能影響細胞抗原表位識別。
- 酶解法操作tips：
- 根據(jù)不同組織類型選擇合適的酶解方案（見表1）。
- 可掃碼查看優(yōu)寧維專屬組織分離指南，幫助您根據(jù)目的細胞類型選擇適宜的解離酶與濃度。
- 酶液需提前在37℃水浴復溫，避免冷酶液直接加入樣本導致細胞應激。
- 酶解在 37℃或室溫孵育20-30min，每10 min輕柔搖晃離心管，以助組織分散，避免超時消化。
表1不同組織解離方案
| 酶種類 | 細分類型 | 貨號 | 特征 |
| 膠原酶 | 膠原酶 I | LS004196、abs47048000 | 用于上皮組織，肝，肺，脂肪和腎上腺組織樣本，可獲取淋巴細胞 |
| 膠原酶 II | LS004176、abs47048001 | 較高的梭菌肽酶 A 含量，通常用于分解心臟，骨，肌肉，甲狀腺和軟骨瘤組織 | |
| 膠原酶 III | LS004180、abs47048002 | 低蛋白水解酶活性，普遍用于乳腺組織 | |
| 膠原酶 IV | LS004186、abs47048003 | 多種蛋白酶成分，能消化多種組織。胰酶活性低，用于消化胰島細胞及對細胞表面受體完整性有較高要求的實驗樣本 | |
| 膠原酶 V | LS005280、abs47048004 | 用于胰島小島、結締組織等 | |
| 胰蛋白酶 | LS003702、abs47014937、abs47047375、SV30031.02 | 需要配合膠原酶或彈性蛋白酶使用 | |
| 木瓜蛋白酶 | LS003126、abs47014927 | 用于皮層神經(jīng)元、視網(wǎng)膜、平滑肌等 | |
| DNA 消化酶 | LS002139、abs47047435 | 適用于單細胞懸液制備中防止細胞成團 | |
3.GentleMACS組織解離系統(tǒng)：基于兩種傳統(tǒng)方法的融合創(chuàng)新，實現(xiàn)組織解離技術的全面革新。
該系統(tǒng)由組織處理器、組織解離試劑盒、專用耗材組成，處理器可外設加熱模塊或冷凍模塊實現(xiàn)溫和細胞或細胞核解離，解離過程高效、自動化、標準化可重復，獲得細胞活性高、抗原表位被極大保護，可保障下游實驗結果真實可靠。
圖1. GentleMACS組織解離系統(tǒng)
GentleMACS組織解離系統(tǒng)操作過程：以腫瘤組織為例
先將預處理的組織樣本與適量酶解緩沖液一并放入專用 gentleMACS 組織解離管。然后將解離管置于主機上，通過預設或自定義程序進行自動化解離。程序完成后，取出解離管，即可通過過濾或離心快速獲得高質量單細胞懸液。
雖然流程清晰簡單易懂，但為確保解離效能，小優(yōu)總結以下高頻問題給大家提前避坑：
Q1. MACS組織解離專用耗材C管與M管分別適用于哪種實驗場景？
需注意！gentle MACS組織處理器必須與組織解離管配套使用，避免因使用不兼容的耗材導致儀器損壞、程序錯誤或樣本損失。
Q2. GentleMACS組織解離系統(tǒng)操作過程中是否需要人為干預？
選好程序啟動后，設備即進入全自動流程，無需人工值守與手動干預。該設計可規(guī)避不同操作者手法差異與計時誤差，能夠實現(xiàn)解離結果的高度標準化、可重復性與一致性，大幅提升實驗效率與可靠性。
Q3. GentleMACS組織解離系統(tǒng)是否只能提取細胞？
不僅能提取細胞，還可通過搭配Cooler模塊與專用耗材（#130-130-533），快速、溫和獲取細胞核。該系統(tǒng)能在保持細胞核完整性與活性的同時，確保高重復性與標準化流程。
Q4. GentleMACS組織解離系統(tǒng)還有哪些特殊應用?
該系統(tǒng)還可適配心臟或肝臟灌流等特殊前處理。通過特定灌流程序與專用耗材（#130-128-151），實現(xiàn)自動化、可控的器官原位灌流，高效清除血液并均勻分布消化酶，顯著提升細胞得率與活性。
Q5. 針對樣本罕見，沒有專屬試劑盒怎么辦？
美天旎通用型多組織解離試劑盒，如 Multi Tissue Dissociation Kit 1/2（#130-110-201/ 130-110-203）可提供標準化的替代方案。該試劑盒1型和2型核心區(qū)別在于分別適配不同組織類型與酶解策略（見表2）。此外，也可在通用試劑盒基礎上，調整酶解時間、溫度，或補加特定酶（如透明質酸酶）進行實驗條件優(yōu)化。
表2 Multi Tissue Dissociation Kit 1型/2型核心區(qū)別
| 特性 | Multi Tissue Dissociation Kit 1 | Multi Tissue Dissociation Kit 2 |
| 核心設計 | 溫和、標準型 | 強力、復雜型 |
| 主要酶組成 | 主要含膠原酶和分散酶，作用相對溫和 | 含膠原酶、分散酶、彈性蛋白酶及更高活性的酶，酶系更全面、作用更強 |
| 適用組織類型 | 適用于標準、較易解離的軟組織 •脾臟、胸腺、淋巴結 • 肝臟、腎臟 • 某些腫瘤組織 |
適用堅韌、纖維化或特別復雜組織 • 實體瘤（尤其纖維化腫瘤） • 心臟、大腦 • 皮膚、脂肪 • 纖維化或硬化組織 |
Q6. 組織上機前是否需要預剪切？
預剪切并非固定步驟，關鍵取決于組織類型。為確保解離效果一致，避免過度解離或細胞損傷，建議嚴格按照說明書要求判斷是否預先剪切。
Q7. 腫瘤組織如何選用合適的組織處理器操作程序？（以人腫瘤組織解離試劑盒#130-095-929為例）
需判斷組織軟硬程度，選擇對應的研磨程序類型（如圖2）。搭配對應組織處理器和組織解離試劑盒提供的研磨程序進行選擇。軟組織（如黑色素瘤、結腸癌等）優(yōu)先選溫和研磨程序，減少細胞損傷；硬組織（如乳腺癌、胰腺癌、肝癌等）可選用加強研磨程序，保障解離充分。 根據(jù)軟硬程度選擇好適配的程序類型后，也需注意解離儀器不同，對應的操作程序也有所不同，具體如下：
圖2 腫瘤組織軟硬程度分類
（1）若使用帶加熱功能的 gentleMACS™ Octo 解離儀器，根據(jù)下表選擇適宜程序，運行結束后可直接按說明書操作進行下一步。
圖3 加熱款腫瘤組織研磨程序示例
（2）若使用常規(guī)gentleMACS™解離儀或非加熱模式的gentleMACS Octo 解離儀，無論腫瘤是柔軟、中等硬度還是堅硬型，首先統(tǒng)一運行 gentleMACS 程序 h_tumor_01，按說明書操作步驟處理后，進行第二次程序（如圖4）。運行結束后，進行第三次程序處理（如圖5）。
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| 圖4 常規(guī)款腫瘤組織研磨程序示例1 | 圖5 常規(guī)款腫瘤組織研磨程序示例2 |
Q8. 罕見組織樣本找不到對應的組織解離程序怎么辦？
罕見組織樣本沒有特定標準化解離程序，可咨詢優(yōu)寧維技術獲取推薦方案，也可參考說明書中的通用程序摸索最佳處理方案！
Q9. 沒有Gentle MACS組織處理器，可以單獨用解離試劑盒嗎？
可以，因為美天旎的試劑盒是經(jīng)過嚴格篩選與優(yōu)化配比的優(yōu)質酶解方案。若解離試劑盒不搭配儀器使用，可參考解離試劑盒說明書中“通道2”程序的運行時間（如圖3），自行摸索酶濃度優(yōu)化實驗條件。
圖6 說明書“通道2“程序示例
Q10. 單次實驗上機樣本量是多少？
需根據(jù)實際樣本量折算，但要嚴格根據(jù)樣本量添加解離試劑（如圖4），避免因試劑不足影響解離效率。
圖7 以腫瘤組織解離試劑盒說明書為例
MACS組織解離熱賣產(chǎn)品：
| 品類 | 貨號 | 產(chǎn)品名稱 |
| 組織處理器 | 130-093-235 | gentleMACS™ Dissociator |
| 130-134-029 | gentleMACS™ Octo Dissociator with Heaters | |
| 組織解離試劑盒 | 130-095-927 | Lung Dissociation Kit, mouse |
| 130-095-929 | Tumor Dissociation Kit, human | |
| 130-096-730 | Tumor Dissociation Kit, mouse | |
| 專用耗材 | 130-093-237 | gentleMACS™ C Tubes |
| 130-093-236 | gentleMACS™ M Tubes | |
| 130-128-151 | gentleMACS™ Perfusers | |
| 130-134-029 | GentleMACS Octo with Heater | |
| 130-130-533 | gentleMACS™ Octo Coolers |
血液樣本
如何根據(jù)不同需求選擇合適的外周血處理方法？
裂紅法與密度梯度離心法實驗流程及操作tips
1.裂紅法： 特異性裂解紅細胞，富集有活白細胞，以制備細胞懸液。
- 操作tips：
- 溶血素需4℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配；若操作小鼠或大鼠的血源樣本，操作溫度建議升至37℃，適當增加孵育時間
- 裂紅體積應在全血體積的3-5倍左右，建議裂紅3-5 min。避免裂解時間過長損傷細胞抗原表位及細胞狀態(tài)，時間過短則裂解不充分。
裂紅試劑熱賣產(chǎn)品：
| 貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
| 130-094-183 | Red Blood Cell Lysis Solution (10x) | 50mL |
| abs9241 | 紅細胞裂解液（10x） | 100mL/500ml |
| abs9101 | 紅細胞裂解液（1x） | 100mL/500ml |
| 555899 | BD FACSTM Lysing Solution（10X）（不含固定劑） | 100mL |
| 349202 | BD FACSTM Lysing Solution 10X Concentrate（含固定劑） | 100mL |
2.密度梯度離心：使用密度梯度介質，利用細胞密度差異實現(xiàn)分層，富集目標細胞。
- 操作tips：
- 根據(jù)樣本來源及目標細胞類型，選用對應密度參數(shù)的Ficoll分離細胞。且使用前需恢復至室溫（18-20℃），以確保最佳分離效果
常用分離細胞Ficoll密度參數(shù)如下：
1.077 g/mL：分離人外周血、臍帶血及骨髓中單個核細胞
1.073 g/mL：人基質細胞、間充質干細胞（MSC）等低密度細胞
1.084 g/ml：分離大鼠、小鼠血液及骨髓中單個核細胞
- 合適的分離溫度應保持在18-20°C。溫度過高分離介質密度較低，影響分離效果及細胞活性；溫度過低，PBMC無法有效富集于分離膠界面，導致分層模糊、紅細胞污染及細胞回收率顯著下降。
- 離心過程中，離心機應緩升緩降，避免因離心機震動影響細胞分層
圖8. 密度梯度離心分層示意圖
細胞分離相關產(chǎn)品：
| 貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 | 適用細胞類型 |
| 17089109 | PERCOLL | 6x1L | 通用細胞分離，可用來分離中性粒細胞、單核細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞，巨噬細胞、病毒等 |
| 17544501 | PERCOLL PLUS | 1L | |
| abs9102 | 細胞分離液 | 100mL | |
| 17144002 | FICOLL PAQUE PLUS 1.077 | 6x100mL | 人外周血，臍帶血，組織中分離單個核細胞，其中PREMIUM為更高級別細胞分離液，內素更低，可用于臨床研究。 |
| 17144003 | FICOLL PAQUE PLUS 1.077 | 6x500mL | |
| 17544202 | FICOLL PAQUE PREMIUM 1.077 | 6x100mL | |
| 17544203 | FICOLL PAQUE PREMIUM 1.077 | 6x500mL | |
| abs930 | 人淋巴細胞分離液 | 200mL | |
| 17544602 | FICOLL PAQUE PREMIUM 1.084 | 6x100ML | 大 / 小鼠、血液、骨髓、組織中分離單個核細胞 |
| 17544652 | FICOLL PAQUE PREMIUM 1.073 | 6x100ML | 人低密度細胞，如基質細胞，間充質干細胞 |
優(yōu)化細胞懸液質量
我們獲得的單細胞懸液可能會有一些細胞團塊、細胞碎片、死細胞等影響后續(xù)分選過程如干擾磁珠標記、堵塞分選柱，導致細胞分選純度與得率下降。因此，我們可以選用以下細胞優(yōu)化試劑提升細胞質量：
1.篩網(wǎng)過濾：使用孔徑適宜的細胞篩網(wǎng)對粗提細胞懸液進行過濾，以去除未充分解離的組織團塊。(MACS® SmartStrainers70μm#130-098-462或70um細胞篩網(wǎng)#abs7232）
2.碎片去除試劑：利用密度梯度離心的原理快速、有效去除細胞碎片（Debris Removal Solution#130-109-398或細胞分離液#abs9102）
3.死細胞去除：磁珠標記死細胞表面的磷脂酰絲氨酸，通過高強度磁場，將死細胞去除（ Dead Cell Removal Kit #130-090-101）
4.裂紅試劑：利用滲透壓差，裂解無核紅細胞。（Red Blood Cell Lysis Solution (10×)#130-094-183或紅細胞裂解液（1×）#abs9101）
注：若您后續(xù)進行細胞培養(yǎng)，則不需要裂紅；若是磁珠分選或測序，則需要進行裂紅和細胞碎片去除
細胞狀態(tài)評估
經(jīng)質量優(yōu)化后的單細胞懸液需評估細胞活性，確保細胞活率＞85%，以保證磁珠標記效率獲得理想的分選結果。
1.血球計數(shù)板：
圖9. 血球計數(shù)板示意圖
- 用無水乙醇（或 95%）擦拭計數(shù)板，晾干，取一張干凈蓋玻片覆在計數(shù)板上
- 滴加適量單細胞懸液，確保無氣泡且分布均勻
- 顯微鏡觀察，計數(shù)四角方格的細胞，遵循“計上不計下、計左不計右”原則
- 按公式計算濃度與活率：
濃度（cells/mL）=（四大格細胞總數(shù)÷4）×稀釋倍數(shù)×10⁴；
活率（%）=（活細胞數(shù)÷總細胞數(shù)）×100%
2.細胞計數(shù)儀：
圖10. 細胞計數(shù)儀操作示意圖
（1）將單細胞懸液按說明書比例與臺盼藍（abs42028917）染液混合
（2）取10-20μL混合液加至專用計數(shù)板
（3）計數(shù)板插入儀器指定卡槽，等待讀取細胞濃度、活率及粒徑分布等數(shù)據(jù)
注：若目的細胞比例過高（≥90%），超出磁珠的最大上限量，應重新評估分選的必要性，優(yōu)先考慮直接使用或選擇陰性去除方案。
