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DAP-seq技術(shù)助力揭示獨(dú)腳金內(nèi)酯調(diào)控蘋(píng)果腋芽生長(zhǎng)的分子機(jī)制
2025年10月14日，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)李威教授團(tuán)隊(duì)在Plant Physiology（IF=6.9）上發(fā)表了一篇題為“Strigolactones inhibit axillary bud outgrowth through transcription factor MdSPL6-mediated regulation of ABA levels in apple”的研究論文。該研究借助DAP-seq技術(shù)，揭示了獨(dú)腳金內(nèi)酯通過(guò)MdSPL6-MdSMXL7模塊調(diào)控下游靶基因，進(jìn)而介導(dǎo)脫落酸積累以抑制蘋(píng)果側(cè)芽生長(zhǎng)的完整信號(hào)通路，為蘋(píng)果株型改良和高產(chǎn)育種提供了關(guān)鍵基因靶點(diǎn)和理論依據(jù)。藍(lán)景科信為該研究提供了DAP-seq技術(shù)支持。
側(cè)枝發(fā)育是影響植物株型構(gòu)建和作物產(chǎn)量的關(guān)鍵形態(tài)特征，蘋(píng)果腋芽的休眠特性往往制約其早分枝進(jìn)程與果實(shí)生產(chǎn)效率。植物激素在腋芽生長(zhǎng)調(diào)控中發(fā)揮核心作用，其中獨(dú)腳金內(nèi)酯（SLs）作為類(lèi)胡蘿卜素衍生激素，已被證實(shí)是抑制植物分枝的關(guān)鍵因子，但其在多年生木本植物（如蘋(píng)果）中的分子調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明�，F(xiàn)有研究表明，SLs信號(hào)通路的關(guān)鍵抑制因子SMXL與SPL轉(zhuǎn)錄因子存在相互作用，但蘋(píng)果中SPL基因是否直接調(diào)控分枝、SLs與脫落酸（ABA）在腋芽休眠調(diào)控中的協(xié)同作用機(jī)制仍有待明確。因此，解析SLs調(diào)控蘋(píng)果腋芽生長(zhǎng)的分子網(wǎng)絡(luò)，明確關(guān)鍵基因功能及激素互作關(guān)系，對(duì)蘋(píng)果株型改良和產(chǎn)量提升相關(guān)研究具有重要的實(shí)踐意義。
主要研究結(jié)果
核心發(fā)現(xiàn)一：驗(yàn)證獨(dú)腳金內(nèi)酯對(duì)蘋(píng)果側(cè)芽生長(zhǎng)的抑制作用
研究團(tuán)隊(duì)采用不同濃度SLs合成類(lèi)似物rac-GR24處理去頂蘋(píng)果枝條，同時(shí)設(shè)置DMSO對(duì)照組及不去頂對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，持續(xù)觀測(cè)不同節(jié)位側(cè)芽的長(zhǎng)度與萌發(fā)率。結(jié)果顯示，rac-GR24處理組的腋芽長(zhǎng)度顯著短于對(duì)照組（11天時(shí)長(zhǎng)僅為對(duì)照組的31.25%），且多節(jié)點(diǎn)腋芽的萌發(fā)率也呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)（第4、5節(jié)點(diǎn)無(wú)萌發(fā)），證實(shí)SLs能有效抑制蘋(píng)果腋芽的萌發(fā)與伸長(zhǎng)。
主要研究結(jié)果
核心發(fā)現(xiàn)一：驗(yàn)證獨(dú)腳金內(nèi)酯對(duì)蘋(píng)果側(cè)芽生長(zhǎng)的抑制作用
研究團(tuán)隊(duì)采用不同濃度SLs合成類(lèi)似物rac-GR24處理去頂蘋(píng)果枝條，同時(shí)設(shè)置DMSO對(duì)照組及不去頂對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，持續(xù)觀測(cè)不同節(jié)位側(cè)芽的長(zhǎng)度與萌發(fā)率。結(jié)果顯示，rac-GR24處理組的腋芽長(zhǎng)度顯著短于對(duì)照組（11天時(shí)長(zhǎng)僅為對(duì)照組的31.25%），且多節(jié)點(diǎn)腋芽的萌發(fā)率也呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)（第4、5節(jié)點(diǎn)無(wú)萌發(fā)），證實(shí)SLs能有效抑制蘋(píng)果腋芽的萌發(fā)與伸長(zhǎng)。
圖1 rac-GR24處理對(duì)蘋(píng)果腋芽生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)
核心發(fā)現(xiàn)二：解析獨(dú)腳金內(nèi)酯（SLs）信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制
1、鎖定SLs調(diào)控蘋(píng)果腋芽生長(zhǎng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)酵母雙雜交篩選蘋(píng)果側(cè)芽cDNA文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)SLs信號(hào)通路關(guān)鍵抑制子MdSMXL7與SPL轉(zhuǎn)錄因子MD06G1204000（MdSPL6）存在相互作用。隨后，研究團(tuán)隊(duì)利用酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)、熒光素酶互補(bǔ)成像及體外pull-down等多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合亞細(xì)胞定位與轉(zhuǎn)錄激活分析，進(jìn)一步證實(shí)SLs信號(hào)通路抑制因子MdSMXL7與轉(zhuǎn)錄因子MdSPL6可在細(xì)胞核內(nèi)直接相互作用。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建Mdspl6突變體后開(kāi)展表型分析，結(jié)果顯示突變體側(cè)枝數(shù)量顯著增加。以上結(jié)果證明，MdSPL6是蘋(píng)果腋芽生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子，且其具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
1、鎖定SLs調(diào)控蘋(píng)果腋芽生長(zhǎng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)酵母雙雜交篩選蘋(píng)果側(cè)芽cDNA文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)SLs信號(hào)通路關(guān)鍵抑制子MdSMXL7與SPL轉(zhuǎn)錄因子MD06G1204000（MdSPL6）存在相互作用。隨后，研究團(tuán)隊(duì)利用酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)、熒光素酶互補(bǔ)成像及體外pull-down等多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合亞細(xì)胞定位與轉(zhuǎn)錄激活分析，進(jìn)一步證實(shí)SLs信號(hào)通路抑制因子MdSMXL7與轉(zhuǎn)錄因子MdSPL6可在細(xì)胞核內(nèi)直接相互作用。研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建Mdspl6突變體后開(kāi)展表型分析，結(jié)果顯示突變體側(cè)枝數(shù)量顯著增加。以上結(jié)果證明，MdSPL6是蘋(píng)果腋芽生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子，且其具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
圖2 MdSMXL7與MdSPL6相互作用的驗(yàn)證
圖3 蘋(píng)果MdSPL6的功能分析
2、全基因組范圍鑒定MdSPL6下游靶基因
為鑒定MdSPL6下游靶基因，本研究開(kāi)展了DNA親和純化測(cè)序（DAP-seq）。結(jié)果顯示MdSPL6在蘋(píng)果基因組中存在11127個(gè)高置信度結(jié)合峰，其核心結(jié)合基序?yàn)镚TAC，該基序也是不同物種SPL轉(zhuǎn)錄因子中的保守序列。GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示，MdSPL6的靶基因顯著富集于植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中在脫落酸（ABA）相關(guān)通路中富集尤為明顯。研究團(tuán)隊(duì)據(jù)此進(jìn)一步篩選出MdHB53和MdTCP1為關(guān)鍵候選靶基因。
為鑒定MdSPL6下游靶基因，本研究開(kāi)展了DNA親和純化測(cè)序（DAP-seq）。結(jié)果顯示MdSPL6在蘋(píng)果基因組中存在11127個(gè)高置信度結(jié)合峰，其核心結(jié)合基序?yàn)镚TAC，該基序也是不同物種SPL轉(zhuǎn)錄因子中的保守序列。GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示，MdSPL6的靶基因顯著富集于植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中在脫落酸（ABA）相關(guān)通路中富集尤為明顯。研究團(tuán)隊(duì)據(jù)此進(jìn)一步篩選出MdHB53和MdTCP1為關(guān)鍵候選靶基因。
圖4 通過(guò)DNA親和純化測(cè)序（DAP-seq）鑒定MdSPL6的靶基因
核心發(fā)現(xiàn)三：解析ABA積累抑制蘋(píng)果側(cè)芽生長(zhǎng)的完整信號(hào)通路
1、鎖定ABA為SL-MdSPL6通路調(diào)控腋芽生長(zhǎng)的關(guān)鍵下游介質(zhì)
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)rac-GR24處理后腋芽激素含量，發(fā)現(xiàn)處理后ABA水平顯著上升，而IAA、ZR、GA₃含量則呈顯著下降趨勢(shì)；過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，MdSPL6過(guò)表達(dá)可引起愈傷組織中ABA含量大幅增加，表明MdSPL6可能通過(guò)調(diào)控ABA的合成來(lái)抑制腋芽生長(zhǎng)。此外，外源ABA處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其能顯著抑制腋芽伸長(zhǎng)；而ABA合成抑制劑氟啶酮處理，則能促進(jìn)腋芽生長(zhǎng)。以上結(jié)果表明，SLs可通過(guò)MdSPL6促進(jìn)ABA的積累，而ABA是抑制蘋(píng)果側(cè)芽生長(zhǎng)的直接效應(yīng)因子。
1、鎖定ABA為SL-MdSPL6通路調(diào)控腋芽生長(zhǎng)的關(guān)鍵下游介質(zhì)
研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)rac-GR24處理后腋芽激素含量，發(fā)現(xiàn)處理后ABA水平顯著上升，而IAA、ZR、GA₃含量則呈顯著下降趨勢(shì)；過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，MdSPL6過(guò)表達(dá)可引起愈傷組織中ABA含量大幅增加，表明MdSPL6可能通過(guò)調(diào)控ABA的合成來(lái)抑制腋芽生長(zhǎng)。此外，外源ABA處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其能顯著抑制腋芽伸長(zhǎng)；而ABA合成抑制劑氟啶酮處理，則能促進(jìn)腋芽生長(zhǎng)。以上結(jié)果表明，SLs可通過(guò)MdSPL6促進(jìn)ABA的積累，而ABA是抑制蘋(píng)果側(cè)芽生長(zhǎng)的直接效應(yīng)因子。
圖5 rac-GR24處理及MdSPL6過(guò)表達(dá)對(duì)蘋(píng)果內(nèi)源激素水平的影響
2、MdSPL6通過(guò)靶基因MdTCP18和MdHB53調(diào)控ABA水平的分子路徑
為進(jìn)一步研究MdSPL6調(diào)控ABA水平的分子路徑，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)酵母單雜交、DAP-qPCR、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及電泳遷移率變動(dòng)分析，驗(yàn)證了MdSPL6可直接轉(zhuǎn)錄激活MdHB53和MdTCP18，且rac-GR24處理可上調(diào)這兩個(gè)基因的表達(dá)；而MdSMXL7可抑制MdSPL6的轉(zhuǎn)錄激活功能，rac-GR24則能通過(guò)促進(jìn)MdSMXL7降解，解除該抑制作用。
研究團(tuán)隊(duì)隨后在蘋(píng)果愈傷組織和擬南芥中開(kāi)展過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)ABA水平及分枝表型。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)MdHB53能顯著提升ABA水平，并直接激活A(yù)BA合成相關(guān)基因MdNCED1的轉(zhuǎn)錄；過(guò)表達(dá)MdTCP18則可恢復(fù)擬南芥bre1bre2突變體的分枝表型，同時(shí)提高其體內(nèi)ABA水平。以上結(jié)果表明，MdHB53通過(guò)調(diào)控MdNCED1介導(dǎo)ABA合成，MdTCP18通過(guò)ABA代謝影響分枝發(fā)育，兩者共同參與SL-MdSPL6通路對(duì)蘋(píng)果腋芽生長(zhǎng)的抑制過(guò)程。
為進(jìn)一步研究MdSPL6調(diào)控ABA水平的分子路徑，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)酵母單雜交、DAP-qPCR、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及電泳遷移率變動(dòng)分析，驗(yàn)證了MdSPL6可直接轉(zhuǎn)錄激活MdHB53和MdTCP18，且rac-GR24處理可上調(diào)這兩個(gè)基因的表達(dá)；而MdSMXL7可抑制MdSPL6的轉(zhuǎn)錄激活功能，rac-GR24則能通過(guò)促進(jìn)MdSMXL7降解，解除該抑制作用。
研究團(tuán)隊(duì)隨后在蘋(píng)果愈傷組織和擬南芥中開(kāi)展過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)ABA水平及分枝表型。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)MdHB53能顯著提升ABA水平，并直接激活A(yù)BA合成相關(guān)基因MdNCED1的轉(zhuǎn)錄；過(guò)表達(dá)MdTCP18則可恢復(fù)擬南芥bre1bre2突變體的分枝表型，同時(shí)提高其體內(nèi)ABA水平。以上結(jié)果表明，MdHB53通過(guò)調(diào)控MdNCED1介導(dǎo)ABA合成，MdTCP18通過(guò)ABA代謝影響分枝發(fā)育，兩者共同參與SL-MdSPL6通路對(duì)蘋(píng)果腋芽生長(zhǎng)的抑制過(guò)程。
圖6 MdSPL6對(duì)MdHB53和MdTCP18表達(dá)的調(diào)控
圖7 MdHB53和MdTCP18參與蘋(píng)果腋芽的調(diào)控
小結(jié)
小結(jié)
本研究首次完整闡明了“SLs-MdSMXL7-MdSPL6-MdHB53/MdTCP18-ABA”的級(jí)聯(lián)調(diào)控通路在蘋(píng)果腋芽生長(zhǎng)中的作用機(jī)制，揭示了SLs與ABA信號(hào)在木本植物中的協(xié)同調(diào)控模式，填補(bǔ)了多年生果樹(shù)分枝調(diào)控分子機(jī)制研究的相關(guān)空白。同時(shí)，該研究為后續(xù)通過(guò)基因編輯、分子標(biāo)記輔助育種等技術(shù)開(kāi)展蘋(píng)果分枝特性定向改良研究提供了核心的基因靶點(diǎn)參考。
圖8 獨(dú)腳金內(nèi)酯（SLs）通過(guò)MdSPL6-MdSMXL7介導(dǎo)調(diào)控蘋(píng)果腋芽生長(zhǎng)的作用模型
標(biāo)簽：
DAP-seq
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