《歐洲藥典》2.6.41通則“高通量測(cè)序（High-throughput Sequencing，HTS，也稱作NGS）檢測(cè)外源病毒因子”將于2026年4月1日起正式生效。”NGS 技術(shù)正式成為生物制品外源病毒質(zhì)控的合規(guī)方法，行業(yè)也從 “要不要用 NGS” 的討論，進(jìn)入了 “怎么把 NGS 方法做合規(guī)、做扎實(shí)” 的實(shí)操落地階段。

在《NGS外源病毒檢測(cè)-適用場(chǎng)景和方法驗(yàn)證策略》一文中，梳理了“NGS 方法能用在哪、驗(yàn)證要覆蓋哪些核心維度”的基礎(chǔ)問題。（點(diǎn)擊此處閱讀）

本期我們將聚焦 NGS 方法學(xué)驗(yàn)證落地的核心關(guān)鍵 —— 驗(yàn)證用病毒標(biāo)準(zhǔn)盤，聊一聊什么樣的標(biāo)準(zhǔn)盤符合國(guó)際法規(guī)要求？如何完成標(biāo)準(zhǔn)盤的規(guī)范制備與全性能驗(yàn)證？

WHO在2024年1月正式發(fā)表的文章：“A Collaborative Study to Evaluate the Proposed First WHO International Reference Panel for Adventitious Virus Detection in Biological Products by High-throughput Sequencing (HTS) Technologies”，依據(jù)不同的病毒基因組類型、有無(wú)包膜和理化抗性等推薦了7種病毒作為NGS外源病毒檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)盤（表1）。

表1. WHO第一版NGS外源病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)盤

結(jié)合最新發(fā)布的EP 2.6.41章節(jié)和ICH Q5A(R2)指導(dǎo)原則，本文旨在闡明NGS外源病毒檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)品的模型病毒選擇策略和制備要點(diǎn)，提供標(biāo)準(zhǔn)盤在方法驗(yàn)證中的實(shí)際應(yīng)用指南。

01 驗(yàn)證用病毒標(biāo)準(zhǔn)盤選擇策略與制備標(biāo)準(zhǔn)
EP 2.6.41章節(jié)提到“為了確保HTS測(cè)試的有效性，每次HTS檢測(cè)都需要隨行外部或內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照，尤其對(duì)于Genomics或Viromics Approach分析方法，設(shè)置的對(duì)照病毒應(yīng)包含一定數(shù)量的DNA和RNA病毒或病毒樣顆粒，摻入合適的基質(zhì)中”。在正式實(shí)驗(yàn)之前，有必要對(duì)NGS外源病毒檢測(cè)的方法進(jìn)行驗(yàn)證，以證明該檢測(cè)方法有足夠的靈敏度和特異性。

加標(biāo)材料選擇
通常在Genomics或Viromics Approach的分析方法中，使用模式病毒加標(biāo)到檢測(cè)體系中，而Transcriptomics approach則需要加標(biāo)感染后的細(xì)胞。加標(biāo)材料的選擇應(yīng)基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估并考慮到樣品類型、分析策略和檢測(cè)方法的預(yù)期用途等因素。驗(yàn)證用的加標(biāo)材料可能有不同的來(lái)源，例如模型病毒或感染后的細(xì)胞，應(yīng)當(dāng)關(guān)注它們的溯源、成分和純度等關(guān)鍵信息，以便正確評(píng)估該方法的性能。

如采用Transcriptomic approach檢測(cè)細(xì)胞基質(zhì)/細(xì)胞庫(kù)，則不同病毒感染的細(xì)胞為最佳加標(biāo)物質(zhì)。模式病毒感染后的細(xì)胞也需要注釋感染vs非感染細(xì)胞數(shù)量，病毒基因表達(dá)的確認(rèn)，病毒序列和宿主背景等參數(shù)。

參考品選擇
章節(jié)3.2. SELECTION OF SPIKING MATERIAL FOR VALIDATION中，明確提到采用基因組學(xué)和病毒組學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞基質(zhì)/細(xì)胞庫(kù)、病毒種子和收獲物的分析方法，相應(yīng)的參考品應(yīng)為具備代表性的模型病毒，且應(yīng)充分考量它們的病毒特性，基因組類型（單雙鏈、DNA/RNA、線性/環(huán)狀、基因組大小）、物理特性（顆粒大小、有無(wú)包膜）和化學(xué)特性（低、中和高抗性）。

標(biāo)準(zhǔn)盤選擇
以WHO國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)盤為例，明確其用途為生物制品NGS外源病毒檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)盤提供了7種不同病毒類型（REO、FeLV, RSV, PCV, EBV, hCoV和MVM），建議將其作為驗(yàn)證用模型病毒的最小標(biāo)準(zhǔn)盤。以上模型病毒需注釋基因組拷貝數(shù)、感染滴度、病毒基因組序列（包括任何變體）以及任何其他的背景信號(hào)等參數(shù)。

02 SHENTEK^® NGS 病毒標(biāo)準(zhǔn)盤制備流程和等效性驗(yàn)證
湖州申科依托自有外源風(fēng)險(xiǎn)因子質(zhì)控平臺(tái)，立足于對(duì)國(guó)內(nèi)生物制藥行業(yè)的理解和客戶需求，推出了自有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的SHENTEK^® NGS外源病毒檢測(cè)體系。同時(shí)參考國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，建立了符合生物制品質(zhì)量控制要求的病毒標(biāo)準(zhǔn)盤。

• 標(biāo)準(zhǔn)盤由7種模式病毒組成（REO、MLV、RSV、PCV、EBV、BVDV和MVM）(表2）。
• 標(biāo)準(zhǔn)盤加入了生物制品行業(yè)中常見污染的牛源病毒BVDV和鼠源病毒MLV，更為貼近生物制藥行業(yè)的需求。
• 標(biāo)準(zhǔn)盤依據(jù)EP 2.6.41章節(jié)和ICH Q5A（R2）指導(dǎo)原則進(jìn)行了充分的性能驗(yàn)證，可達(dá)到與WHO標(biāo)準(zhǔn)盤等效的性能。

表2. SHENTEK^® NGS驗(yàn)證用病毒標(biāo)準(zhǔn)盤

SHENTEK^® NGS驗(yàn)證用病毒標(biāo)準(zhǔn)盤采用可溯源的種子病毒生產(chǎn)的高濃度病毒原液，經(jīng)超速離心和切向流濃縮換液后獲得，具有高純度和低宿主殘留的特點(diǎn)（圖1），可滿足生物制品NGS外源病毒檢測(cè)的要求。

圖1. 病毒標(biāo)準(zhǔn)品制備流程

病毒標(biāo)準(zhǔn)盤的性能驗(yàn)證
參照WHO發(fā)布的病毒標(biāo)準(zhǔn)盤的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)，湖州申科對(duì)新建的NGS驗(yàn)證用病毒標(biāo)準(zhǔn)盤進(jìn)行了系統(tǒng)的性能驗(yàn)證,主要包括系統(tǒng)適用性、檢測(cè)限、專屬性及檢測(cè)范圍三個(gè)部分。

• 系統(tǒng)適用性驗(yàn)證: 對(duì)工作流程中關(guān)鍵步驟（核酸提取、文庫(kù)構(gòu)建、生信分析）進(jìn)行驗(yàn)證質(zhì)控以評(píng)估該系統(tǒng)的性能。
• 檢測(cè)限驗(yàn)證：不同類型的病毒標(biāo)準(zhǔn)品按照基因組拷貝，按10倍梯度稀釋至理論檢測(cè)下限（1E5、1E4、1E3、1E2 VGC/mL），摻入到1E9 VGC/mL的Adv5中進(jìn)行測(cè)試，在設(shè)置的檢出標(biāo)準(zhǔn)下檢測(cè)限可達(dá)10³GC/mL。
• 專屬性（及檢測(cè)范圍）驗(yàn)證：在基質(zhì)樣品中混合多種病毒參考品，驗(yàn)證多種病毒共存時(shí)的鑒別能力。最終結(jié)果中，混合病毒全部穩(wěn)定檢出，無(wú)其他假陽(yáng)性檢出。

表3. SHENTEK^® NGS驗(yàn)證檢測(cè)用病毒標(biāo)準(zhǔn)的COA

03 驗(yàn)證用病毒標(biāo)準(zhǔn)盤的使用注意事項(xiàng)
從行業(yè)需求和現(xiàn)行法規(guī)要求出發(fā)，NGS外源病毒檢查法適用于細(xì)胞庫(kù)和病毒庫(kù)的檢定，以及細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品的中間環(huán)節(jié)放行檢。雖然ICH Q5（R2）指導(dǎo)原則中明確指出，NGS方法用于替代體內(nèi)法和替代/補(bǔ)充體外法進(jìn)行外源病毒檢測(cè)，無(wú)需做頭對(duì)頭的比較，但在正式實(shí)驗(yàn)前仍有必要對(duì)NGS方法進(jìn)行充分驗(yàn)證或確認(rèn)。加入病毒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行NGS外源病毒檢查方法驗(yàn)證的目的，在于驗(yàn)證NGS外源病毒檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)流程是否具有足夠的特異性、靈敏度和樣品適用性。

因此針對(duì)外源病毒檢測(cè)的特定場(chǎng)景，病毒標(biāo)準(zhǔn)盤的加入可以實(shí)現(xiàn)NGS檢測(cè)全流程質(zhì)控，從樣品準(zhǔn)備和核酸提取、文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序、以及生信分析。除提供高質(zhì)量的病毒標(biāo)準(zhǔn)盤以外，合理的病毒標(biāo)準(zhǔn)品摻入方式、高效的核酸提取和文庫(kù)構(gòu)建策略，以及經(jīng)驗(yàn)證的生信分析流程才能保證上述的病毒標(biāo)準(zhǔn)盤在性能驗(yàn)證中穩(wěn)定檢出。

注：病毒標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)在BSL-2實(shí)驗(yàn)室操作，實(shí)驗(yàn)人員需經(jīng)過生物安全上崗培訓(xùn)且應(yīng)正確穿戴個(gè)人防護(hù)用品(PPE)。