從發(fā)現(xiàn)到靶向蛋白質(zhì)組學(xué)：基于MRMHR肽段定量完整工作流程
生物標(biāo)志物在疾病診斷、監(jiān)測、預(yù)后判斷及治療方案選擇中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。各類生物標(biāo)志物的常規(guī)檢測為疾病治療、早期發(fā)現(xiàn)和疾病診斷分級提供了重要支撐。本文介紹了一套完整的數(shù)據(jù)分析工作流：基于ZenoTOF 7600系統(tǒng)(SCIEX)，利用PEAKS Studio 13.1軟件(Bioinformatics Solutions Inc,BSI），實現(xiàn)從DDA的發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)，到基于MRMHR的靶向定量分析。
前言
蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物備受關(guān)注的核心原因在于其是絕大多數(shù)生物學(xué)過程的主要執(zhí)行者[2]。因此，對其進行深入分析可以揭示疾病的內(nèi)在發(fā)生機制，有助于全面理解當(dāng)下所研究的臨床課題。為助力新型生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，我們基于PEAKS Studio軟件與ZenoTOF 7600系統(tǒng)，構(gòu)建了一套全面且精簡的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)工作流。已有研究表明，借助Zeno阱可提升的序列覆蓋率，ZenoTOF 7600系統(tǒng)既能實現(xiàn)全面的蛋白質(zhì)表征，又能對治療用蛋白藥物進行靈敏定量[3]。
Figure 1. Comprehensive Workflow for MRMHR-based Peptide Quantitation in PEAKS Studio. A. PEAKS Studio supports discovery proteomics data acquired using ZenoTOF 7600 or 8600 systems. Using a novel tool, Transition List Generator, users can create the precursor list of desired targets and export it in a format directly supported by SCIEX OS. B. Output precursor list is imported and acquired using SCIEX MRMHR methodology. C. PEAKS Studio MRMHR data analysis includes automated, or user directed Target Peptide Quantification.
實驗方法
Table 3. PEAKS Studio DDA search.
Table 4. PEAKS Studio MRMHR peptide quantification parameters.
研究結(jié)果
我們整合了發(fā)現(xiàn)與靶向定量工作流，利用TNF-α 標(biāo)準(zhǔn)蛋白驗證了PEAKS Studio對MRMHR數(shù)據(jù)的分析能力。對TNF-α蛋白胰蛋白酶酶解產(chǎn)物進行DDA分析，結(jié)果表明，在PSM FDR<1%及protein score>20的過濾條件下，共檢測到89個特異性肽段，蛋白序列覆蓋率達(dá)64.81%。
將ZenoTOF 7600系統(tǒng)Zeno阱的高靈敏度優(yōu)勢，與從頭測序輔助數(shù)據(jù)庫搜索及PEAKS獨特的PTM搜索算法結(jié)合，除未修飾肽段外，還可同時識別多種修飾肽段，最終將蛋白序列覆蓋率提升至73.39%(Figure 2)。
Figure 2. Sequence coverage view in PEAKS Studio for TNFA_HUMAN (P01375).
在對目標(biāo)肽段的定量分析與篩選過程中，需考慮以下要點：所選特征肽段需具備可與基質(zhì)有效區(qū)分的獨特序列，且該肽段不易發(fā)生化學(xué)修飾、不含翻譯后修飾位點。通過Transition List Generator，篩選出3條未修飾的目標(biāo)肽段，用于后續(xù)的MRMHR采集(Figure 3)。具體而言，用戶可搜索并篩選目標(biāo)母離子，確保所選母離子在LC-MS map view 中及選定的保留時間窗口內(nèi)無信號重疊；此外，用戶還可在注釋譜圖視圖中對碎片離子進行驗證。軟件適配SCIEX OS中的自定義導(dǎo)出按鈕，可將所選目標(biāo)以兼容格式導(dǎo)出，用于MRMHR采集。
MRMHR數(shù)據(jù)無需轉(zhuǎn)換格式可直接導(dǎo)入PEAKS Studio軟件，并按照前文所述參數(shù)，通過內(nèi)置的自動化非標(biāo)記PRM工作流完成數(shù)據(jù)分析。
Figure 3. PEAKS Transition List Generator View. Transition List Generator supports data import from any DDA/DIA PEAKS analysis result, pre-created precursor list, and Spectral Library (including the .blib format). A compatible precursor list export for SCIEX OS is available.
我們基于3條特異性未修飾肽段完成了蛋白質(zhì)定量分析，定量結(jié)果與預(yù)期符合，含量呈現(xiàn)遞增趨勢。
Figure 4. A. Target Peptide quantification.B. Target Protein quantification.
Figure 5. Peptide quantification with manual editing and validation.
討論
本篇應(yīng)用驗證了一套聯(lián)合PEAKS Studio軟件與ZenoTOF 7600系統(tǒng)，可用于新型生物標(biāo)志物靈敏發(fā)現(xiàn)與定量的研究策略。以TNF-α標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解產(chǎn)物為研究對象，通過PEAKS Studio13.1完成了一套精簡準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)分析流程，包括發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析、已鑒定目標(biāo)母離子篩選，以及最終通過自動化PRM工作流程實現(xiàn)靶向肽段定量。我們還進一步驗證了PEAKS Studio在碎片離子編輯和保留時間的調(diào)整的靈活性，且所有分析結(jié)果完整透明、可追溯。
參考文獻
[1]Wenk, D., Zuo, C., Kislinger, T. et al. Recent developments in mass-spectrometry-based targeted proteomics of clinical cancer biomarkers. Clin Proteom 21, 6 (2024). https://doi.org/10.1186/s12014-024-09452-1.
[2]Yaffe MB. Why geneticists stole cancer research even though cancer is primarily a signaling disease. Sci Signal.2019 Jan 22;12(565):eaaw3483. doi: 10.1126/scisignal.aaw3483. PMID: 30670634.
[3]Enhanced sensitivity for peptide quantification in a complex matrix using high-resolution LC-MS/MS. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-13324-A.
作為生物信息學(xué)的領(lǐng)軍企業(yè)，BSI專注于蛋白質(zhì)組學(xué)和生物藥領(lǐng)域，通過機器學(xué)習(xí)和先進算法提供世界領(lǐng)先的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件和蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)解決方案，以推進生物學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn)。我們通過基于AI的計算方案，為您提供對蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和醫(yī)學(xué)的卓越洞見。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數(shù)千家學(xué)術(shù)和工業(yè)用戶，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽組發(fā)現(xiàn)服務(wù)和抗體綜合表征服務(wù)等。
前言
蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物備受關(guān)注的核心原因在于其是絕大多數(shù)生物學(xué)過程的主要執(zhí)行者[2]。因此，對其進行深入分析可以揭示疾病的內(nèi)在發(fā)生機制，有助于全面理解當(dāng)下所研究的臨床課題。為助力新型生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，我們基于PEAKS Studio軟件與ZenoTOF 7600系統(tǒng)，構(gòu)建了一套全面且精簡的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)工作流。已有研究表明，借助Zeno阱可提升的序列覆蓋率，ZenoTOF 7600系統(tǒng)既能實現(xiàn)全面的蛋白質(zhì)表征，又能對治療用蛋白藥物進行靈敏定量[3]。
PEAKS Studio軟件支持對ZenoTOF 7600系統(tǒng)的原始數(shù)據(jù)進行高靈敏度、高可靠性的組學(xué)數(shù)據(jù)分析，然后從DDA或數(shù)據(jù)非依賴采集(SWATH或ZT掃描)數(shù)據(jù)結(jié)果中篩選目標(biāo)母離子，供下一步的靶向數(shù)據(jù)采集；然后通過PRM工作流，對目標(biāo)母離子對應(yīng)的肽段/蛋白質(zhì)進行定量(Figure 1)。我們通過對TNF-α 蛋白的靈敏準(zhǔn)確定量，驗證了該流程的準(zhǔn)確性。
Figure 1. Comprehensive Workflow for MRMHR-based Peptide Quantitation in PEAKS Studio. A. PEAKS Studio supports discovery proteomics data acquired using ZenoTOF 7600 or 8600 systems. Using a novel tool, Transition List Generator, users can create the precursor list of desired targets and export it in a format directly supported by SCIEX OS. B. Output precursor list is imported and acquired using SCIEX MRMHR methodology. C. PEAKS Studio MRMHR data analysis includes automated, or user directed Target Peptide Quantification.
實驗方法
- 樣品制備
- 色譜條件
Table 1. LC method.
- 質(zhì)譜分析
Table 2. Source, gas, and MS conditions.
- 數(shù)據(jù)處理
Table 3. PEAKS Studio DDA search.
Table 4. PEAKS Studio MRMHR peptide quantification parameters.
我們整合了發(fā)現(xiàn)與靶向定量工作流，利用TNF-α 標(biāo)準(zhǔn)蛋白驗證了PEAKS Studio對MRMHR數(shù)據(jù)的分析能力。對TNF-α蛋白胰蛋白酶酶解產(chǎn)物進行DDA分析，結(jié)果表明，在PSM FDR<1%及protein score>20的過濾條件下，共檢測到89個特異性肽段，蛋白序列覆蓋率達(dá)64.81%。
將ZenoTOF 7600系統(tǒng)Zeno阱的高靈敏度優(yōu)勢，與從頭測序輔助數(shù)據(jù)庫搜索及PEAKS獨特的PTM搜索算法結(jié)合，除未修飾肽段外，還可同時識別多種修飾肽段，最終將蛋白序列覆蓋率提升至73.39%(Figure 2)。
Figure 2. Sequence coverage view in PEAKS Studio for TNFA_HUMAN (P01375).
在對目標(biāo)肽段的定量分析與篩選過程中，需考慮以下要點：所選特征肽段需具備可與基質(zhì)有效區(qū)分的獨特序列，且該肽段不易發(fā)生化學(xué)修飾、不含翻譯后修飾位點。通過Transition List Generator，篩選出3條未修飾的目標(biāo)肽段，用于后續(xù)的MRMHR采集(Figure 3)。具體而言，用戶可搜索并篩選目標(biāo)母離子，確保所選母離子在LC-MS map view 中及選定的保留時間窗口內(nèi)無信號重疊；此外，用戶還可在注釋譜圖視圖中對碎片離子進行驗證。軟件適配SCIEX OS中的自定義導(dǎo)出按鈕，可將所選目標(biāo)以兼容格式導(dǎo)出，用于MRMHR采集。
MRMHR數(shù)據(jù)無需轉(zhuǎn)換格式可直接導(dǎo)入PEAKS Studio軟件，并按照前文所述參數(shù)，通過內(nèi)置的自動化非標(biāo)記PRM工作流完成數(shù)據(jù)分析。
Figure 3. PEAKS Transition List Generator View. Transition List Generator supports data import from any DDA/DIA PEAKS analysis result, pre-created precursor list, and Spectral Library (including the .blib format). A compatible precursor list export for SCIEX OS is available.
我們基于3條特異性未修飾肽段完成了蛋白質(zhì)定量分析，定量結(jié)果與預(yù)期符合，含量呈現(xiàn)遞增趨勢。
Figure 4. A. Target Peptide quantification.B. Target Protein quantification.
除了基于優(yōu)化的內(nèi)部算法和訓(xùn)練模型自動選擇用于母離子定量的碎片離子外，PEAKS Studio還支持用戶根據(jù)自身需求，對碎片離子進行重新評估與篩選(Figure 5)。軟件提供便捷的保留時間滑動窗口功能，可將碎片離子調(diào)整到滑塊區(qū)間中心，進而實現(xiàn)對該范圍內(nèi)峰面積的精確積分。在此過程中，用戶還可評估根據(jù)經(jīng)驗設(shè)置的保留時間窗口內(nèi)的基質(zhì)干擾。此外，軟件還能自動可視化展示每個肽段的二級質(zhì)譜(MS/MS)熱圖。
Figure 5. Peptide quantification with manual editing and validation.
討論
本篇應(yīng)用驗證了一套聯(lián)合PEAKS Studio軟件與ZenoTOF 7600系統(tǒng)，可用于新型生物標(biāo)志物靈敏發(fā)現(xiàn)與定量的研究策略。以TNF-α標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶解產(chǎn)物為研究對象，通過PEAKS Studio13.1完成了一套精簡準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)分析流程，包括發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析、已鑒定目標(biāo)母離子篩選，以及最終通過自動化PRM工作流程實現(xiàn)靶向肽段定量。我們還進一步驗證了PEAKS Studio在碎片離子編輯和保留時間的調(diào)整的靈活性，且所有分析結(jié)果完整透明、可追溯。
參考文獻
[1]Wenk, D., Zuo, C., Kislinger, T. et al. Recent developments in mass-spectrometry-based targeted proteomics of clinical cancer biomarkers. Clin Proteom 21, 6 (2024). https://doi.org/10.1186/s12014-024-09452-1.
[2]Yaffe MB. Why geneticists stole cancer research even though cancer is primarily a signaling disease. Sci Signal.2019 Jan 22;12(565):eaaw3483. doi: 10.1126/scisignal.aaw3483. PMID: 30670634.
[3]Enhanced sensitivity for peptide quantification in a complex matrix using high-resolution LC-MS/MS. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-13324-A.
作為生物信息學(xué)的領(lǐng)軍企業(yè)，BSI專注于蛋白質(zhì)組學(xué)和生物藥領(lǐng)域，通過機器學(xué)習(xí)和先進算法提供世界領(lǐng)先的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件和蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)解決方案，以推進生物學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn)。我們通過基于AI的計算方案，為您提供對蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和醫(yī)學(xué)的卓越洞見。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數(shù)千家學(xué)術(shù)和工業(yè)用戶，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽組發(fā)現(xiàn)服務(wù)和抗體綜合表征服務(wù)等。
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