從單細(xì)胞到翻譯后修飾組學(xué)的超高靈敏定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析
質(zhì)譜技術(shù)驅(qū)動的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，正朝著更高靈敏度、更優(yōu)定量精度、更廣應(yīng)用場景快速發(fā)展，儀器平臺的升級正是核心驅(qū)動力之一。近日，Matthias Mann團(tuán)隊與SCIEX合作，在bioRxiv發(fā)表最新研究“Scanning DIA on the ZenoTOF 8600 system enables ultrasensitive and quantitative proteomics from single cells to post-translational modifications in a compact platform”，實現(xiàn)了從單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)到疾病相關(guān)翻譯后修飾(PTM)檢測的全場景覆蓋，兼具超高靈敏度、定量準(zhǔn)確性和檢測通量，為蛋白質(zhì)組學(xué)從基礎(chǔ)研究到臨床轉(zhuǎn)化提供了全新工具。經(jīng)測試，新建方法體系每天可對500個樣品的進(jìn)行高通量分析，在單細(xì)胞中可鑒定多達(dá)4,700個蛋白質(zhì)，在混合物種樣本基準(zhǔn)測試中可實現(xiàn)精準(zhǔn)比例的定量，以及利用互補(bǔ)的CID和EAD碎裂方式，在帕金森細(xì)胞模型中鑒定與疾病相關(guān)的磷酸化修飾等。本研究中所有的非靶向組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析均采用PEAKS Studio 13.1完成。
01--基于ZT Scan DIA 的蛋白質(zhì)組學(xué)定性定量
研究團(tuán)隊基于ZenoTOF 8600，將ZT Scan DIA與傳統(tǒng)可變窗口DIA(Zeno SWATH DIA)在進(jìn)行對比，質(zhì)譜上機(jī)均為250 ng HEK 293T 細(xì)胞裂解液，結(jié)果統(tǒng)計見Figure 1b-e，可以看出ZT Scan DIA能鑒定到更多肽段和蛋白組，對比同條件下的傳統(tǒng)可變窗口 DIA，鑒定深度大幅提升；定量方面，蛋白組水平中位變異系數(shù)（CV）低至 2.8%，優(yōu)于傳統(tǒng)DIA的3.4%，且CV＜20% 的蛋白組占比進(jìn)一步提升。這一結(jié)果證實，連續(xù)掃描的 ZT Scan DIA 能在相同上樣量的情況下，同時實現(xiàn)更深的覆蓋度和更精準(zhǔn)的定量，解決了傳統(tǒng)DIA鑒定與定量的平衡難題。
Figure 1. zenoTOF 8600組件原理及與其他平臺性能對比
02--不同通量樣本的深度檢測結(jié)果
蛋白質(zhì)組學(xué)研究對通量和檢測深度的需求因場景而異，選用ZenoTOF 8600在全通量范圍內(nèi)開展相關(guān)分析(Fig.2a-f)。對于超高通量分析需求，可實現(xiàn)500樣本/天(500 SPD)的分析，200 ng K562細(xì)胞裂解液可鑒定～4800個蛋白組，20 ng微量樣本仍能鑒定～3200個蛋白組，該性能接近前一代ZenoTOF 7600+在60 SPD下的檢測深度；酵母樣本在500 SPD下也能鑒定～3200個蛋白，證實該平臺的性能與物種特異性無關(guān)。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的分析需求對儀器靈敏度的較高，ZenoTOF 8600在單個HeLa細(xì)胞中可鑒定3000-4700個蛋白組(中位數(shù)約3900），空白對照僅鑒定～300個蛋白，排除了污染/殘留的干擾；3個細(xì)胞和10個細(xì)胞混合樣本則分別達(dá)到～5300和～6300個蛋白的鑒定，接近復(fù)雜樣本的檢測深度。
03--定量準(zhǔn)確性驗證
定量準(zhǔn)確性是蛋白質(zhì)組學(xué)臨床轉(zhuǎn)化的核心要求，團(tuán)隊采用已知比例的人/酵母/大腸桿菌混合物種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行儀器定量準(zhǔn)確性的驗證(500 ng質(zhì)譜上樣量)，人源蛋白比例固定為50%，酵母和大腸桿菌蛋白占比從5%到45%反向變化，鑒定和定量結(jié)果見Figure 3。從Fig.3a-b可以看出，人源蛋白的鑒定數(shù)保持穩(wěn)定，表明檢測不受其他基質(zhì)組成的干擾；Fig.3c的定量比值與理論值高度吻合，人源蛋白log2比值標(biāo)準(zhǔn)差僅0.44，大腸桿菌（最大倍性變化）也僅0.66，無明顯系統(tǒng)偏差；結(jié)合ZT Scan DIA的蛋白水平CV中位數(shù)＜4%，其定量精度已接近三重四極桿的靶向檢測水平。
Figure 3. ZenoTOF 8600對混合物種樣本的精準(zhǔn)定量
04--靶向定量分析應(yīng)用
ZenoTOF 8600 具有Zeno MRMHR(高分辨多反應(yīng)監(jiān)測)靶向模式，提供4種分辨率可選，兼顧選擇性和靈敏度(檢測結(jié)果見Fig.4a-h)。ZT Scan DIA和MRMHR模式下，色譜峰半高寬(FWHM)內(nèi)可獲得≥7個數(shù)據(jù)點，采樣密度充足，保證峰面積積分的準(zhǔn)確性。靈敏度低至埃摩爾，在250 ng HEK背景基質(zhì)中，VVGGLVALR肽段的柱上檢測限低至2.7 attomole，線性范圍跨4個數(shù)量級(R²=0.988)。定量精準(zhǔn)，可定量范圍內(nèi)CV中位數(shù)僅3.2%，實測濃度與理論值偏差＜20%，中位回收率101.6%，且保留完整MS/MS譜圖，可實現(xiàn)分析物確證，降低假陽性。支持在同一儀器上無縫切換發(fā)現(xiàn)型DIA和靶向型MRMHR，無需在不同平臺重新開發(fā)方法，加速從候選物發(fā)現(xiàn)到驗證的轉(zhuǎn)化流程。
05--雙碎裂模式在PTM檢測中的應(yīng)用
翻譯后修飾(如磷酸化)的檢測存在兩大難點：修飾肽段相對于非修飾肽來說往往是亞化學(xué)計量的，并且位點定位需要高質(zhì)量碎裂譜。ZenoTOF 8600的雙碎裂模式(CID+EAD) 可以解決這一問題，研究團(tuán)隊以帕金森病關(guān)鍵靶點α-突觸核蛋白S129磷酸化(pS129)為模型進(jìn)行驗證(結(jié)果見Fig.5a-g)。PFF處理誘導(dǎo)HEK細(xì)胞α-突觸核蛋白聚集后，pS129磷酸肽在處理組中信號顯著升高，對照組幾乎無信號，且三次生物學(xué)重復(fù)檢測重現(xiàn)性優(yōu)異(Fig.5b)，表明高特異性的檢測。此外，雙碎裂模式下，CID產(chǎn)生完整的b/y離子，實現(xiàn)肽段骨架精準(zhǔn)測序，但無法保留磷酸化修飾；EAD產(chǎn)生c/z離子完整保留不穩(wěn)定的磷酸化修飾，并延伸了C端肽段的覆蓋度，實現(xiàn)pS129位點的高置信度定位(Fig.5f-g)。
Matthias Mann教授團(tuán)隊也在文末特別致謝了我司提供了PEAKS軟件在數(shù)據(jù)分析和技術(shù)方面的支持。BSI作為PEAKS系列軟件的開發(fā)者，很榮幸參與到本研究中，在此也感謝研究團(tuán)隊對PEAKS在蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析領(lǐng)域，特別是在DIA數(shù)據(jù)分析的核心價值的肯定與認(rèn)可。
借助強(qiáng)大的PEAKS Studio 13.1軟件，可以最大限度的幫研究者解析出譜圖中包含的鑒定信息和準(zhǔn)確的定量結(jié)果，并且PEAKS Studio也兼容 DDA、DIA 和靶向數(shù)據(jù)分析功能，與先進(jìn)的儀器結(jié)合，可以實現(xiàn)更加完整的一站式蛋白質(zhì)組學(xué)研究。如果需要進(jìn)一步了解軟件的功能與應(yīng)用，您可以通過文末的聯(lián)系方式預(yù)約一對一技術(shù)介紹。
作為生物信息學(xué)的領(lǐng)軍企業(yè)，BSI專注于蛋白質(zhì)組學(xué)和生物藥領(lǐng)域，通過機(jī)器學(xué)習(xí)和先進(jìn)算法提供世界領(lǐng)先的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件和蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)解決方案，以推進(jìn)生物學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn)。我們通過基于AI的計算方案，為您提供對蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和醫(yī)學(xué)的卓越洞見。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數(shù)千家學(xué)術(shù)和工業(yè)用戶，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽組發(fā)現(xiàn)服務(wù)和抗體綜合表征服務(wù)等。
01--基于ZT Scan DIA 的蛋白質(zhì)組學(xué)定性定量
研究團(tuán)隊基于ZenoTOF 8600，將ZT Scan DIA與傳統(tǒng)可變窗口DIA(Zeno SWATH DIA)在進(jìn)行對比，質(zhì)譜上機(jī)均為250 ng HEK 293T 細(xì)胞裂解液，結(jié)果統(tǒng)計見Figure 1b-e，可以看出ZT Scan DIA能鑒定到更多肽段和蛋白組，對比同條件下的傳統(tǒng)可變窗口 DIA，鑒定深度大幅提升；定量方面，蛋白組水平中位變異系數(shù)（CV）低至 2.8%，優(yōu)于傳統(tǒng)DIA的3.4%，且CV＜20% 的蛋白組占比進(jìn)一步提升。這一結(jié)果證實，連續(xù)掃描的 ZT Scan DIA 能在相同上樣量的情況下，同時實現(xiàn)更深的覆蓋度和更精準(zhǔn)的定量，解決了傳統(tǒng)DIA鑒定與定量的平衡難題。
Figure 1. zenoTOF 8600組件原理及與其他平臺性能對比
02--不同通量樣本的深度檢測結(jié)果
蛋白質(zhì)組學(xué)研究對通量和檢測深度的需求因場景而異，選用ZenoTOF 8600在全通量范圍內(nèi)開展相關(guān)分析(Fig.2a-f)。對于超高通量分析需求，可實現(xiàn)500樣本/天(500 SPD)的分析，200 ng K562細(xì)胞裂解液可鑒定～4800個蛋白組，20 ng微量樣本仍能鑒定～3200個蛋白組，該性能接近前一代ZenoTOF 7600+在60 SPD下的檢測深度；酵母樣本在500 SPD下也能鑒定～3200個蛋白，證實該平臺的性能與物種特異性無關(guān)。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的分析需求對儀器靈敏度的較高，ZenoTOF 8600在單個HeLa細(xì)胞中可鑒定3000-4700個蛋白組(中位數(shù)約3900），空白對照僅鑒定～300個蛋白，排除了污染/殘留的干擾；3個細(xì)胞和10個細(xì)胞混合樣本則分別達(dá)到～5300和～6300個蛋白的鑒定，接近復(fù)雜樣本的檢測深度。
Figure 2. 不同通量設(shè)置和不同上樣量的深度蛋白組覆蓋
03--定量準(zhǔn)確性驗證
定量準(zhǔn)確性是蛋白質(zhì)組學(xué)臨床轉(zhuǎn)化的核心要求，團(tuán)隊采用已知比例的人/酵母/大腸桿菌混合物種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行儀器定量準(zhǔn)確性的驗證(500 ng質(zhì)譜上樣量)，人源蛋白比例固定為50%，酵母和大腸桿菌蛋白占比從5%到45%反向變化，鑒定和定量結(jié)果見Figure 3。從Fig.3a-b可以看出，人源蛋白的鑒定數(shù)保持穩(wěn)定，表明檢測不受其他基質(zhì)組成的干擾；Fig.3c的定量比值與理論值高度吻合，人源蛋白log2比值標(biāo)準(zhǔn)差僅0.44，大腸桿菌（最大倍性變化）也僅0.66，無明顯系統(tǒng)偏差；結(jié)合ZT Scan DIA的蛋白水平CV中位數(shù)＜4%，其定量精度已接近三重四極桿的靶向檢測水平。
Figure 3. ZenoTOF 8600對混合物種樣本的精準(zhǔn)定量
04--靶向定量分析應(yīng)用
ZenoTOF 8600 具有Zeno MRMHR(高分辨多反應(yīng)監(jiān)測)靶向模式，提供4種分辨率可選，兼顧選擇性和靈敏度(檢測結(jié)果見Fig.4a-h)。ZT Scan DIA和MRMHR模式下，色譜峰半高寬(FWHM)內(nèi)可獲得≥7個數(shù)據(jù)點，采樣密度充足，保證峰面積積分的準(zhǔn)確性。靈敏度低至埃摩爾，在250 ng HEK背景基質(zhì)中，VVGGLVALR肽段的柱上檢測限低至2.7 attomole，線性范圍跨4個數(shù)量級(R²=0.988)。定量精準(zhǔn)，可定量范圍內(nèi)CV中位數(shù)僅3.2%，實測濃度與理論值偏差＜20%，中位回收率101.6%，且保留完整MS/MS譜圖，可實現(xiàn)分析物確證，降低假陽性。支持在同一儀器上無縫切換發(fā)現(xiàn)型DIA和靶向型MRMHR，無需在不同平臺重新開發(fā)方法，加速從候選物發(fā)現(xiàn)到驗證的轉(zhuǎn)化流程。
Figure 4. 高靈敏度靶向定量
05--雙碎裂模式在PTM檢測中的應(yīng)用
翻譯后修飾(如磷酸化)的檢測存在兩大難點：修飾肽段相對于非修飾肽來說往往是亞化學(xué)計量的，并且位點定位需要高質(zhì)量碎裂譜。ZenoTOF 8600的雙碎裂模式(CID+EAD) 可以解決這一問題，研究團(tuán)隊以帕金森病關(guān)鍵靶點α-突觸核蛋白S129磷酸化(pS129)為模型進(jìn)行驗證(結(jié)果見Fig.5a-g)。PFF處理誘導(dǎo)HEK細(xì)胞α-突觸核蛋白聚集后，pS129磷酸肽在處理組中信號顯著升高，對照組幾乎無信號，且三次生物學(xué)重復(fù)檢測重現(xiàn)性優(yōu)異(Fig.5b)，表明高特異性的檢測。此外，雙碎裂模式下，CID產(chǎn)生完整的b/y離子，實現(xiàn)肽段骨架精準(zhǔn)測序，但無法保留磷酸化修飾；EAD產(chǎn)生c/z離子完整保留不穩(wěn)定的磷酸化修飾，并延伸了C端肽段的覆蓋度，實現(xiàn)pS129位點的高置信度定位(Fig.5f-g)。
Figure 5. 疾病相關(guān)修飾位點的靶向分析
Matthias Mann教授團(tuán)隊也在文末特別致謝了我司提供了PEAKS軟件在數(shù)據(jù)分析和技術(shù)方面的支持。BSI作為PEAKS系列軟件的開發(fā)者，很榮幸參與到本研究中，在此也感謝研究團(tuán)隊對PEAKS在蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析領(lǐng)域，特別是在DIA數(shù)據(jù)分析的核心價值的肯定與認(rèn)可。
借助強(qiáng)大的PEAKS Studio 13.1軟件，可以最大限度的幫研究者解析出譜圖中包含的鑒定信息和準(zhǔn)確的定量結(jié)果，并且PEAKS Studio也兼容 DDA、DIA 和靶向數(shù)據(jù)分析功能，與先進(jìn)的儀器結(jié)合，可以實現(xiàn)更加完整的一站式蛋白質(zhì)組學(xué)研究。如果需要進(jìn)一步了解軟件的功能與應(yīng)用，您可以通過文末的聯(lián)系方式預(yù)約一對一技術(shù)介紹。
作為生物信息學(xué)的領(lǐng)軍企業(yè)，BSI專注于蛋白質(zhì)組學(xué)和生物藥領(lǐng)域，通過機(jī)器學(xué)習(xí)和先進(jìn)算法提供世界領(lǐng)先的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件和蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)解決方案，以推進(jìn)生物學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn)。我們通過基于AI的計算方案，為您提供對蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和醫(yī)學(xué)的卓越洞見。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數(shù)千家學(xué)術(shù)和工業(yè)用戶，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽組發(fā)現(xiàn)服務(wù)和抗體綜合表征服務(wù)等。
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