DAP-seq和RNA-seq聯(lián)合助力揭示SmBBX22調控茄子花青素合成的分子機制
茄子作為重要的經濟作物，其果實及器官富含花青素，具有較高的營養(yǎng)價值和產業(yè)價值。B-box（BBX）轉錄因子是植物中廣泛存在的鋅指蛋白，在植物生長發(fā)育（如開花、光形態(tài)建成）、花青素合成及脅迫響應等過程中發(fā)揮關鍵調控作用，已在擬南芥、番茄、蘋果等多種植物中得到深入研究，但茄子中BBX基因家族的系統(tǒng)鑒定、特征分析及功能機制研究仍較為匱乏。
2025年12月12日，上海交通大學陳火英教授團隊在Horticultural Plant Journal（IF=6.2）期刊上發(fā)表了一篇題為“Genome-wide characterization of B-box gene family in eggplant and functional identification of SmBBX22 in modulating anthocyanin synthesis”的研究論文。該研究通過DAP-seq與RNA-seq技術聯(lián)合分析，成功鑒定出SmBBX22的下游靶基因，明確其通過調控苯丙烷類和黃酮類生物合成通路正向調控茄子花青素合成的分子機制，不僅填補了茄子SmBBX基因家族調控機制的研究空白，更為作物品質改良提供了關鍵分子靶點。
2025年12月12日，上海交通大學陳火英教授團隊在Horticultural Plant Journal（IF=6.2）期刊上發(fā)表了一篇題為“Genome-wide characterization of B-box gene family in eggplant and functional identification of SmBBX22 in modulating anthocyanin synthesis”的研究論文。該研究通過DAP-seq與RNA-seq技術聯(lián)合分析，成功鑒定出SmBBX22的下游靶基因，明確其通過調控苯丙烷類和黃酮類生物合成通路正向調控茄子花青素合成的分子機制，不僅填補了茄子SmBBX基因家族調控機制的研究空白，更為作物品質改良提供了關鍵分子靶點。
研究結果
1. SmBBX基因家族全基因組特征
本研究通過全基因組分析，鑒定出茄子中33個SmBBX基因。系統(tǒng)發(fā)育分析將其分為5個亞家族（I–V）。結構分析顯示，所有SmBBX蛋白均含有1–2個B-box結構域，部分還包含CCT結構域和VP保守基序。研究發(fā)現(xiàn)，96.9%的SmBBX蛋白定位于細胞核；片段復制是該基因家族擴張的主要機制，且與番茄BBX基因具有較高進化保守性。
圖1. 擬南芥、茄子、水稻和番茄中BBX基因的系統(tǒng)發(fā)育分析
圖2. 保守結構域（如B-box）內氨基酸序列的比對
圖3. 茄子中潛在BBX家族基因的系統(tǒng)發(fā)育關系、基序、結構域及基因結構
圖4. 茄子中BBX基因的染色體分布
圖5. 擬南芥、番茄和茄子之間BBX基因的共線性關系
圖6. 潛在調控網(wǎng)絡中推定的miRNA與其靶向的SmBBXs之間的相互作用分析
2. SmBBX的組織表達模式
為了探究33個SmBBX基因在茄子不同發(fā)育階段的功能作用，研究團隊通過RNA-seq分析，鑒定出不表達、組成型表達和組織特異性表達三種模式，其中3個基因全程不表達，8個基因在各組織/器官中組成型高表達（如Smechr0100178.1等），表明其在植物代謝、生長和發(fā)育中具重要作用，14個基因呈組織特異性表達（如Smechr0303381.1在子葉、衰老葉等中高表達），且同一亞家族內表達模式相似。同時，通過qRT-PCR分析了該基因家族在8小時脅迫處理下的表達模式，發(fā)現(xiàn)JA處理激活8個基因，ABA處理上調22個基因，低溫處理Smechr0202811.1上調>20 倍，NaCL處理上調22個基因，PEG處理上調20個基因，藍光處理Smechr1000119.1上調>60 倍，UV處理誘導28個基因且上調與下調基因數(shù)量相等。以上結果表明，SmBBX基因參與多種脅迫響應，其在植物適應和抗逆性中起關鍵作用。
圖7. SmBBXs在不同發(fā)育階段的表達模式
圖8. 基于qRT-PCR的SmBBX基因在不同處理（包括JA、ABA、4°C、NaCl、PEG、藍光和UV-B處理）下的表達模式分析
3.蛋白互作網(wǎng)絡預測與驗證
本研究借助STRING等工具預測了SmBBX蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)3個SmBBX蛋白在家族內部存在相互作用（如Smechr0602096.1與Smechr0402438.1、Smechr0502383.1相互作用），且7個主要位于分支IV和V的SmBBX蛋白可與SmHY5（光形態(tài)建成調控因子）、SmCOP1.1/1.2（負調控因子）等關鍵轉錄因子相互作用。隨后作者通過熒光素酶互補實驗（LCI）驗證，在煙草細胞中共表達nLUC-SmHY5與BBX19-2-cLUC、SmBBX21-2-cLUC、SmBBX22-cLUC及nLUC-COP1.1與BBX19-2-cLUC時，均產生強烈熒光信號，證實了多個SmBBX蛋白與HY5、COP1的相互作用，與預測結果一致。
本研究借助STRING等工具預測了SmBBX蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)3個SmBBX蛋白在家族內部存在相互作用（如Smechr0602096.1與Smechr0402438.1、Smechr0502383.1相互作用），且7個主要位于分支IV和V的SmBBX蛋白可與SmHY5（光形態(tài)建成調控因子）、SmCOP1.1/1.2（負調控因子）等關鍵轉錄因子相互作用。隨后作者通過熒光素酶互補實驗（LCI）驗證，在煙草細胞中共表達nLUC-SmHY5與BBX19-2-cLUC、SmBBX21-2-cLUC、SmBBX22-cLUC及nLUC-COP1.1與BBX19-2-cLUC時，均產生強烈熒光信號，證實了多個SmBBX蛋白與HY5、COP1的相互作用，與預測結果一致。
圖9. SmBBX蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡
圖10. SmBBXs在煙草葉片中與HY5和COP1相互作用
4.SmBBX22是花青素合成關鍵調控因子
先前的轉錄組研究發(fā)現(xiàn)，SmBBX19-2、SmBBX21-2和SmBBX22三個基因與花青素生物合成相關。研究團隊通過雙熒光素酶實驗證實，SmBBX21-2和SmBBX22可激活花青素合成關鍵基因SmCHS和SmDFR的表達，而SmBBX19-2無此激活作用。為進一步驗證SmBBX22的功能，研究人員構建了SmBBX22過表達株系，結果顯示該株系幼苗莖的紫色顯著加深，花青素含量最高提升6.5倍，且花青素合成關鍵基因（AtCHS、AtF3H、AtDFR、AtANS）表達均顯著上調，證實SmBBX22正向調控花青素合成。為闡明SmBBX22在茄子中的生理功能，研究團隊以茄子‘LSHX’為遺傳背景構建了SmBBX22過表達轉基因株系，發(fā)現(xiàn)其愈傷組織紫色更深，花青素含量顯著增加，同時花青素合成結構基因（SmCHI、SmF3H、SmDFR、SmANS）表達明顯上調，表明SmBBX22在調控茄子花青素生物合成中發(fā)揮關鍵作用。此外，研究團隊對轉基因茄子愈傷組織進行RNA-seq分析，共鑒定出2070個差異表達基因；富集分析顯示，這些差異表達基因主要參與次生代謝、苯丙烷類生物合成等通路，其中光調控花青素合成相關的結構基因（如SmF3'5'H）和轉錄因子（如SmTT8、SmHY5）表達顯著上調。以上結果共同證實，SmBBX22是茄子花青素生物合成的關鍵調控因子。
先前的轉錄組研究發(fā)現(xiàn)，SmBBX19-2、SmBBX21-2和SmBBX22三個基因與花青素生物合成相關。研究團隊通過雙熒光素酶實驗證實，SmBBX21-2和SmBBX22可激活花青素合成關鍵基因SmCHS和SmDFR的表達，而SmBBX19-2無此激活作用。為進一步驗證SmBBX22的功能，研究人員構建了SmBBX22過表達株系，結果顯示該株系幼苗莖的紫色顯著加深，花青素含量最高提升6.5倍，且花青素合成關鍵基因（AtCHS、AtF3H、AtDFR、AtANS）表達均顯著上調，證實SmBBX22正向調控花青素合成。為闡明SmBBX22在茄子中的生理功能，研究團隊以茄子‘LSHX’為遺傳背景構建了SmBBX22過表達轉基因株系，發(fā)現(xiàn)其愈傷組織紫色更深，花青素含量顯著增加，同時花青素合成結構基因（SmCHI、SmF3H、SmDFR、SmANS）表達明顯上調，表明SmBBX22在調控茄子花青素生物合成中發(fā)揮關鍵作用。此外，研究團隊對轉基因茄子愈傷組織進行RNA-seq分析，共鑒定出2070個差異表達基因；富集分析顯示，這些差異表達基因主要參與次生代謝、苯丙烷類生物合成等通路，其中光調控花青素合成相關的結構基因（如SmF3'5'H）和轉錄因子（如SmTT8、SmHY5）表達顯著上調。以上結果共同證實，SmBBX22是茄子花青素生物合成的關鍵調控因子。
圖11. 雙熒光素酶報告基因檢測分析
圖12. 茄子愈傷組織中SmBBX22過表達的表型及結構基因表達水平分析
5.解析SmBBX22的調控網(wǎng)絡
為解析SmBBX22的調控機制，研究團隊通過DAP-seq分析，共鑒定出27982個高置信度的SmBBX22結合區(qū)域，這些區(qū)域集中分布在基因啟動子附近；對應3915個啟動子被結合的靶基因，且這些靶基因顯著富集于苯丙烷類生物合成、激素信號轉導和黃酮類化合物生物合成等關鍵通路，同時還揭示了保守的SmBBX22結合基序。作者進一步將DAP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，篩選出355個共調控基因，涵蓋花青素合成關鍵結構基因（如F3'5'H、UF3GT）、激素信號組件（如YUCCA4、PYL2）及轉錄因子（如MYB、bHLH家族成員），明確了SmBBX22直接調控的下游基因網(wǎng)絡。
為解析SmBBX22的調控機制，研究團隊通過DAP-seq分析，共鑒定出27982個高置信度的SmBBX22結合區(qū)域，這些區(qū)域集中分布在基因啟動子附近；對應3915個啟動子被結合的靶基因，且這些靶基因顯著富集于苯丙烷類生物合成、激素信號轉導和黃酮類化合物生物合成等關鍵通路，同時還揭示了保守的SmBBX22結合基序。作者進一步將DAP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，篩選出355個共調控基因，涵蓋花青素合成關鍵結構基因（如F3'5'H、UF3GT）、激素信號組件（如YUCCA4、PYL2）及轉錄因子（如MYB、bHLH家族成員），明確了SmBBX22直接調控的下游基因網(wǎng)絡。
圖13. SmBBX22靶基因的鑒定
小結
本研究鑒定了茄子33個SmBBX基因并分為5個系統(tǒng)發(fā)育組，明確其脅迫響應特征與蛋白互作網(wǎng)絡；證實SmBBX22通過上調花青素合成相關基因、調控苯丙烷類/類黃酮生物合成通路，正向調控茄子花青素積累，為解析BBX基因功能及茄子品質改良提供了關鍵依據(jù)。
PS. 藍景科信為該研究提供了DAP-seq和RNA-seq技術支持。
PS. 藍景科信為該研究提供了DAP-seq和RNA-seq技術支持。
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