DAP-seq技術(shù)助力揭示MeJA緩解桃果實(shí)冷害的分子機(jī)制
2025年11月3日，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所桃遺傳育種團(tuán)隊在Horticulture Research（IF = 8.5）上發(fā)表了一篇題為“JAZ2/JAZ4-MYC2.1 Module Mediates MeJA-Induced Alleviation of Chilling Injury in Peach Fruit (Prunus persica)”的研究論文。該文章借助DAP-seq技術(shù)，揭示了JAZ2/JAZ4-MYC2.1模塊介導(dǎo)MeJA緩解桃果實(shí)冷害的分子機(jī)制。
桃（Prunus persica）作為典型的躍變型果實(shí)，因風(fēng)味佳、營養(yǎng)豐富占據(jù)重要市場地位，但采后冷藏易引發(fā)冷害（CI），表現(xiàn)為表面凹陷、內(nèi)部褐變（IB）、成熟受阻等癥狀，其中內(nèi)部褐變主要由酚類物質(zhì)的酶促氧化導(dǎo)致，嚴(yán)重降低果實(shí)商品性。茉莉酸甲酯（MeJA）作為植物信號分子，已被證實(shí)可增強(qiáng)多種果實(shí)的耐冷性，其作用與乙烯合成、抗氧化能力提升等生理過程相關(guān)，但MeJA介導(dǎo)桃果實(shí)耐冷性的分子機(jī)制，尤其是關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子MYC2的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及JAZ蛋白的調(diào)控作用，尚未明確。
主要研究結(jié)果
核心發(fā)現(xiàn)一：生理層面驗證MeJA耐冷功效
采用1 mM MeJA浸泡處理‘CP9’桃果實(shí)15 min，4℃冷藏28天并系統(tǒng)檢測冷害癥狀及生理指標(biāo)。結(jié)果表明，MeJA處理顯著抑制果實(shí)內(nèi)部褐變（IB）發(fā)展，顯著提高乙烯釋放量，同時促進(jìn)茉莉酸（JA）和茉莉酸-異亮氨酸（JA-Ile）積累；果實(shí)中總酚、類黃酮等抗氧化物質(zhì)含量顯著升高，丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）積累速率及多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）活性顯著降低，有效緩解低溫誘導(dǎo)的氧化損傷和組織劣變。
主要研究結(jié)果
核心發(fā)現(xiàn)一：生理層面驗證MeJA耐冷功效
采用1 mM MeJA浸泡處理‘CP9’桃果實(shí)15 min，4℃冷藏28天并系統(tǒng)檢測冷害癥狀及生理指標(biāo)。結(jié)果表明，MeJA處理顯著抑制果實(shí)內(nèi)部褐變（IB）發(fā)展，顯著提高乙烯釋放量，同時促進(jìn)茉莉酸（JA）和茉莉酸-異亮氨酸（JA-Ile）積累；果實(shí)中總酚、類黃酮等抗氧化物質(zhì)含量顯著升高，丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）積累速率及多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）活性顯著降低，有效緩解低溫誘導(dǎo)的氧化損傷和組織劣變。
圖1 外源茉莉酸甲酯（MeJA）處理緩解桃果實(shí)冷害（CI）癥狀
核心發(fā)現(xiàn)二：基因組水平解析核心轉(zhuǎn)錄因子PpMYC2.1調(diào)控桃果實(shí)耐冷三重響應(yīng)通路
1、鎖定PpMYC2.1為耐冷核心調(diào)控因子
通過對MeJA處理組和對照組不同冷藏時間的果實(shí)進(jìn)行RNA-seq分析，鑒定差異表達(dá)基因（DEGs），并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析、組織特異性表達(dá)譜檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個MYC2（茉莉酸信號分子開關(guān)）同源基因中，僅PpMYC2.1在MeJA處理和冷藏期間被持續(xù)顯著誘導(dǎo)，且其表達(dá)量與乙烯合成、多酚和類黃酮積累呈正相關(guān)，而PpMYC2.2表達(dá)量低且呈負(fù)相關(guān)。免疫印跡分析證實(shí)，MeJA處理可誘導(dǎo)PpMYC2.1蛋白積累，且亞細(xì)胞定位顯示PpMYC2.1定位在細(xì)胞核。以上結(jié)果表明，PpMYC2.1是MeJA誘導(dǎo)桃果實(shí)耐冷性的重要調(diào)控因子，通過整合調(diào)控乙烯信號通路和抗氧化物質(zhì)合成發(fā)揮作用。
1、鎖定PpMYC2.1為耐冷核心調(diào)控因子
通過對MeJA處理組和對照組不同冷藏時間的果實(shí)進(jìn)行RNA-seq分析，鑒定差異表達(dá)基因（DEGs），并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析、組織特異性表達(dá)譜檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個MYC2（茉莉酸信號分子開關(guān)）同源基因中，僅PpMYC2.1在MeJA處理和冷藏期間被持續(xù)顯著誘導(dǎo)，且其表達(dá)量與乙烯合成、多酚和類黃酮積累呈正相關(guān)，而PpMYC2.2表達(dá)量低且呈負(fù)相關(guān)。免疫印跡分析證實(shí)，MeJA處理可誘導(dǎo)PpMYC2.1蛋白積累，且亞細(xì)胞定位顯示PpMYC2.1定位在細(xì)胞核。以上結(jié)果表明，PpMYC2.1是MeJA誘導(dǎo)桃果實(shí)耐冷性的重要調(diào)控因子，通過整合調(diào)控乙烯信號通路和抗氧化物質(zhì)合成發(fā)揮作用。
圖2 PpMYC2.1在茉莉酸甲酯（MeJA）介導(dǎo)的桃果實(shí)茉莉酸（JA）信號通路中發(fā)揮作用
2、全基因組鑒定PpMYC2.1靶基因
為鑒定PpMYC2.1的靶基因，研究開展了DNA親和純化測序（DAP-seq）。結(jié)果顯示，PpMYC2.1在桃基因組中存在9752個高置信度結(jié)合峰，主要富集于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）上游1000bp區(qū)域，其結(jié)合基序為CAC[G/A]TG，與經(jīng)典G-box基序高度相似。進(jìn)一步結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)分析，獲得1920個PpMYC2.1直接靶基因；GO富集分析顯示，這些基因顯著富集于苯丙烷生物合成過程、JA介導(dǎo)的信號通路、乙烯響應(yīng)及細(xì)胞壁大分子分解代謝過程，涉及乙烯合成、細(xì)胞壁降解和苯丙烷代謝等關(guān)鍵通路。
為鑒定PpMYC2.1的靶基因，研究開展了DNA親和純化測序（DAP-seq）。結(jié)果顯示，PpMYC2.1在桃基因組中存在9752個高置信度結(jié)合峰，主要富集于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）上游1000bp區(qū)域，其結(jié)合基序為CAC[G/A]TG，與經(jīng)典G-box基序高度相似。進(jìn)一步結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)分析，獲得1920個PpMYC2.1直接靶基因；GO富集分析顯示，這些基因顯著富集于苯丙烷生物合成過程、JA介導(dǎo)的信號通路、乙烯響應(yīng)及細(xì)胞壁大分子分解代謝過程，涉及乙烯合成、細(xì)胞壁降解和苯丙烷代謝等關(guān)鍵通路。
圖3 DAP-seq與RNA-seq數(shù)據(jù)聯(lián)合分析鑒定到受PpMYC2.1調(diào)控的直接靶基因
3、PpMYC2.1調(diào)控三大耐冷關(guān)鍵通路
通過DAP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析，篩選出乙烯信號通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（PpIAA1、PpERF61、PpHB.G7）、細(xì)胞壁降解相關(guān)基因（PpPL1、PpPG2、PpXTH2）以及苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵基因（PpPAL1、Pp4CL、PpCHI3、PpCHS）。通過Y1H、EMSA、DLR及桃果實(shí)瞬時過表達(dá)和沉默實(shí)驗證實(shí)，PpMYC2.1可直接結(jié)合上述基因的啟動子區(qū)域并調(diào)控其表達(dá)，表明PpMYC2.1在介導(dǎo)MeJA誘導(dǎo)的桃果實(shí)耐冷性中發(fā)揮核心作用。
通過DAP-seq和RNA-seq聯(lián)合分析，篩選出乙烯信號通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（PpIAA1、PpERF61、PpHB.G7）、細(xì)胞壁降解相關(guān)基因（PpPL1、PpPG2、PpXTH2）以及苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵基因（PpPAL1、Pp4CL、PpCHI3、PpCHS）。通過Y1H、EMSA、DLR及桃果實(shí)瞬時過表達(dá)和沉默實(shí)驗證實(shí)，PpMYC2.1可直接結(jié)合上述基因的啟動子區(qū)域并調(diào)控其表達(dá)，表明PpMYC2.1在介導(dǎo)MeJA誘導(dǎo)的桃果實(shí)耐冷性中發(fā)揮核心作用。
圖4 PpMYC2.1介導(dǎo)的桃果實(shí)乙烯合成相關(guān)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的直接調(diào)控
圖5 PpMYC2.1介導(dǎo)的桃果實(shí)細(xì)胞壁降解關(guān)鍵基因的直接調(diào)控
圖6 PpMYC2.1介導(dǎo)的桃果實(shí)多酚和類黃酮合成關(guān)鍵基因的直接調(diào)控
核心發(fā)現(xiàn)三：PpJAZ2/4-MYC2.1模塊調(diào)控機(jī)制與PpMYC2.1耐冷功能的多維驗證
1、PpJAZ2/4-PpMYC2.1模塊在介導(dǎo)MeJA誘導(dǎo)的桃果實(shí)冷適應(yīng)中的功能
JAZ-MYC模塊是JA信號通路中的核心調(diào)控機(jī)制，其中JAZ蛋白作為抑制因子，通過直接結(jié)合并抑制MYC轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的活性，進(jìn)而調(diào)控下游基因表達(dá)。通過系統(tǒng)篩選桃基因組JAZ家族基因，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析、蛋白水平檢測鎖定PpJAZ2/4為候選調(diào)控因子。利用酵母雙雜交（Y2H）、熒光素酶互補(bǔ)成像（LCI）、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）及免疫共沉淀（Co-IP）等實(shí)驗證實(shí)，PpJAZ2/4與PpMYC2.1存在直接物理相互作用，且二者均定位于細(xì)胞核；雙熒光素酶報告基因（DLR）實(shí)驗進(jìn)一步表明，PpJAZ2/4可顯著抑制PpMYC2.1對下游靶基因啟動子的激活活性，而MeJA處理能顯著下調(diào)PpJAZ2/4的轉(zhuǎn)錄與蛋白水平，解除其對PpMYC2.1的抑制效應(yīng)。
1、PpJAZ2/4-PpMYC2.1模塊在介導(dǎo)MeJA誘導(dǎo)的桃果實(shí)冷適應(yīng)中的功能
JAZ-MYC模塊是JA信號通路中的核心調(diào)控機(jī)制，其中JAZ蛋白作為抑制因子，通過直接結(jié)合并抑制MYC轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的活性，進(jìn)而調(diào)控下游基因表達(dá)。通過系統(tǒng)篩選桃基因組JAZ家族基因，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析、蛋白水平檢測鎖定PpJAZ2/4為候選調(diào)控因子。利用酵母雙雜交（Y2H）、熒光素酶互補(bǔ)成像（LCI）、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）及免疫共沉淀（Co-IP）等實(shí)驗證實(shí)，PpJAZ2/4與PpMYC2.1存在直接物理相互作用，且二者均定位于細(xì)胞核；雙熒光素酶報告基因（DLR）實(shí)驗進(jìn)一步表明，PpJAZ2/4可顯著抑制PpMYC2.1對下游靶基因啟動子的激活活性，而MeJA處理能顯著下調(diào)PpJAZ2/4的轉(zhuǎn)錄與蛋白水平，解除其對PpMYC2.1的抑制效應(yīng)。
圖7 PpJAZ2/4抑制PpMYC2.1對其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性
2、PpMYC2.1跨物種功能驗證
為驗證PpMYC2.1在調(diào)控冷害中的功能作用，本研究構(gòu)建PpMYC2.1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄，株系，并對野生型和轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)進(jìn)行4℃冷藏28天處理，檢測冷害癥狀及相關(guān)理化和分子指標(biāo)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因番茄冷害指數(shù)顯著低于WT，乙烯合成量顯著提升，果實(shí)硬度適度下降，MDA和ROS積累減少，總酚、類黃酮含量升高，且乙烯合成（SlACS2、SlACO1）、細(xì)胞壁降解（SlPL1、SlXTH3）及苯丙烷代謝（SlPAL1、SlCHS1）相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明，PpMYC2.1的耐冷功能在不同果實(shí)物種中具有保守性。
為驗證PpMYC2.1在調(diào)控冷害中的功能作用，本研究構(gòu)建PpMYC2.1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因番茄，株系，并對野生型和轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)進(jìn)行4℃冷藏28天處理，檢測冷害癥狀及相關(guān)理化和分子指標(biāo)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因番茄冷害指數(shù)顯著低于WT，乙烯合成量顯著提升，果實(shí)硬度適度下降，MDA和ROS積累減少，總酚、類黃酮含量升高，且乙烯合成（SlACS2、SlACO1）、細(xì)胞壁降解（SlPL1、SlXTH3）及苯丙烷代謝（SlPAL1、SlCHS1）相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明，PpMYC2.1的耐冷功能在不同果實(shí)物種中具有保守性。
圖8 轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中PpMYC2.1過表達(dá)增強(qiáng)耐冷性
小結(jié)
本研究通過多組學(xué)技術(shù)（RNA-seq、DAP-seq）與分子生物學(xué)實(shí)驗相結(jié)合，完整揭示了“MeJA下調(diào)PpJAZ2/4表達(dá)→解除對PpMYC2.1的抑制→激活乙烯合成、細(xì)胞壁重塑及多酚類黃酮合成通路→增強(qiáng)果實(shí)耐冷性”的分子調(diào)控鏈。這一發(fā)現(xiàn)不僅填補(bǔ)了MeJA介導(dǎo)桃果實(shí)耐冷害分子機(jī)制的研究空白，更為躍變型果實(shí)采后冷鏈物流優(yōu)化提供了關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，為開發(fā)高效、綠色的保鮮技術(shù)奠定了堅實(shí)的理論基礎(chǔ)。
藍(lán)景科信為該研究提供了DAP-seq技術(shù)支持。
藍(lán)景科信為該研究提供了DAP-seq技術(shù)支持。
圖9 闡明PpMYC2.1在提升耐冷性中正向調(diào)控作用的工作模型
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