新一代活細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像及功能分析系統(tǒng) CELLCYTE X，可實(shí)時(shí)追蹤并分析球體生長(zhǎng)狀態(tài)與健康程度，為藥物評(píng)估提供客觀量化指標(biāo)（往期文章：《CellCyte X 細(xì)胞球體分析軟件讓 3D 球體實(shí)驗(yàn)更科學(xué)、更輕松》）。

本文將展示 CELLCYTE X 在高通量實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景中的應(yīng)用實(shí)踐，重點(diǎn)呈現(xiàn)其針對(duì)高穩(wěn)定性、高重復(fù)性腫瘤球狀體模型及細(xì)胞遷移模型的長(zhǎng)期實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與多維度功能分析方案。研究以乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-231 為研究對(duì)象，利用 3D 生物打印技術(shù)構(gòu)建球狀體與細(xì)胞遷移模型，通過(guò) CELLCYTE X 活細(xì)胞成像系統(tǒng)，連續(xù) 5–9 天對(duì)模型進(jìn)行非侵入式追蹤監(jiān)測(cè)，系統(tǒng)性對(duì)比 TeloCol^®-10（重組人 Ⅰ 型膠原蛋白）與Matrigel（基底膜基質(zhì)膠）兩種細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）材料的生物學(xué)性能。

研究結(jié)果顯示：TeloCol^®-10 在維持3D腫瘤球狀體的結(jié)構(gòu)完整性與形態(tài)穩(wěn)定性方面顯著優(yōu)于 Matrigel，且兩者生長(zhǎng)速率相當(dāng)；此外，TeloCol^®-10 批次間一致性高，不含腫瘤源性生長(zhǎng)因子干擾，更適用于高通量生物打印及長(zhǎng)期體外藥物篩選。

研究背景：為何需要更穩(wěn)定的 3D 細(xì)胞基質(zhì)？

Matrigel 雖被視為 3D 細(xì)胞培養(yǎng)的“金標(biāo)準(zhǔn)”之一，但其成分復(fù)雜、批次差異顯著，含有多種腫瘤源性生長(zhǎng)因子，且力學(xué)性能調(diào)控性差、樣本硬度不均一，在長(zhǎng)期培養(yǎng)中易發(fā)生降解，液滴也易脫落。相比之下，膠原蛋白作為天然組織的主要成分，生物相容性優(yōu)良，機(jī)械性能可調(diào)。其中，TeloCol^®-10（含 95% I 型膠原蛋白與 5% III 型膠原蛋白）保留了膠原的端肽結(jié)構(gòu)，交聯(lián)更充分，剛度更高，接近乳腺癌基質(zhì)的生理剛度為構(gòu)建更具生理相關(guān)性的3D腫瘤模型提供了理想的基質(zhì)平臺(tái)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：高通量生物打印 + 實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像

1. 細(xì)胞與材料
細(xì)胞：mCherry 標(biāo)記的 MDA‑MB‑231 乳腺癌細(xì)胞。
基質(zhì)：TeloCol®-10（6 mg/mL 或 4 mg/mL）和 Matrigel（6 mg/mL 或 4 mg/mL）。
打印方式：采用定制生物分配器，在 96 孔板中打印 1 μL 細(xì)胞‑水凝膠混合液滴。

圖1. TeloCol^®-10稀釋至6 mg/mL和4 mg/mL時(shí)的儲(chǔ)存模量

2. 兩種檢測(cè)模型

球狀體形成模型構(gòu)建方法：將終濃度為 6 mg/mL的TeloCol^®-10或Matrigel水凝膠與細(xì)胞懸液通過(guò)兩支注射器反復(fù)推拉30次充分混勻，裝入預(yù)冷至2℃的生物分配儀中，在96孔板內(nèi)打印1 μL載細(xì)胞液滴，隨后置于37℃培養(yǎng)箱中熱交聯(lián)（TeloCol^®-10約15分鐘，Matrigel約25分鐘），每孔加入300 μL培養(yǎng)基，每3天半量換液，連續(xù)培養(yǎng)5天用于球狀體形成觀察。

細(xì)胞侵襲遷移模型（液滴嵌套式）構(gòu)建方法：參照上述方法打印1 μL載細(xì)胞的內(nèi)核液滴（6 mg/mL），經(jīng)37℃交聯(lián)后，在內(nèi)核完全凝膠化的基礎(chǔ)上，于其外層打印5 μL無(wú)細(xì)胞的4 mg/mL水凝膠以形成包裹結(jié)構(gòu)，再次進(jìn)行熱交聯(lián)，隨后同樣每孔加入300 μL培養(yǎng)基、每3天半量換液，連續(xù)培養(yǎng)9天以追蹤細(xì)胞從內(nèi)核向外層的侵襲遷移行為。

圖2. TeloCol^®-10/Matrigel 的球狀體（液滴）與遷移模型（液滴嵌套式） 3D 生物打印及分析流程概覽

3. 實(shí)時(shí)成像與定量分析

使用新一代活細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像及功能分析系統(tǒng) CELLCYTE X，每 3 小時(shí)采集一次明場(chǎng)與紅色熒光圖像（4×物鏡），連續(xù)監(jiān)測(cè) 5–9 天，并借助系統(tǒng)自帶的球體分析模塊 CELLCYTE Studio，對(duì)總熒光強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理（Ft/Fi），量化細(xì)胞的生長(zhǎng)與聚集情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：TeloCol^®-10在穩(wěn)定性上突出，Matrigel 易降解

✅ 球狀體形成：兩種基質(zhì)均能支持球體形成，但穩(wěn)定性差異顯著

TeloCol^®-10組：第 3 天開(kāi)始聚集成團(tuán)并形成類球體，持續(xù)生長(zhǎng)至第 5 天（圖 3A）。

Matrigel組：細(xì)胞第 2 天即形成類球體（圖 3B）。第 3 天起，Matrigel液滴邊緣開(kāi)始降解，細(xì)胞團(tuán)被推向孔板中央，部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。第 4–5 天，小型類球體融合為大團(tuán)簇，貼壁細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)占據(jù)孔底大部分區(qū)域。熒光監(jiān)測(cè)顯示，兩組細(xì)胞生長(zhǎng)速率一致（圖 4）。

本結(jié)果證實(shí) TeloCol^®-10 在此體系中穩(wěn)定性更優(yōu)。

圖3. TeloCol^®-10 與 Matrigel 中 MDA-MB-231 球狀體形成及降解對(duì)比

圖4. 相對(duì)熒光強(qiáng)度顯示 TeloCol^®-10 與 Matrigel 中細(xì)胞增殖速率基本一致

✅ 遷移模型：TeloCol^®-10可維持完整結(jié)構(gòu)長(zhǎng)達(dá) 7 天以上

TeloCol^®-10組 與Matrigel組細(xì)胞均在第 3 天開(kāi)始從內(nèi)核向外層遷移，后續(xù)幾天大量遷移。伴隨細(xì)胞遷出，內(nèi)核層降解，中央形成類球體團(tuán)，與類球體模型中降解現(xiàn)象一致。第 7 天，Matrigel組外層開(kāi)始降解收縮，向中央聚集，孔底留下細(xì)胞遷移軌跡�？傮w而言，TeloCol^®-10組模型可連續(xù)監(jiān)測(cè)遷移至第 9 天；Matrigel組模型細(xì)胞第 7 天已遷移至外層邊緣（圖5）。

圖5. TeloCol^®-10 與 Matrigel 中的液滴嵌套式遷移模型對(duì)比（9天動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）

✅ Matrigel 易降解的核心原因

類球體與遷移實(shí)驗(yàn)中觀察到的Matrigel 降解，與生長(zhǎng)細(xì)胞的蛋白水解作用相關(guān)。1 μL 小體積液滴、4–6 mg/mL 濃度、高細(xì)胞密度均可能加劇降解。薄層的Matrigel 易形成異常結(jié)構(gòu)，細(xì)胞傾向于單層生長(zhǎng)。此外，Matrigel 蛋白與生長(zhǎng)因子組成的差異會(huì)影響凝膠力學(xué)性能、細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移與實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。前期實(shí)驗(yàn)顯示，換液或加藥時(shí)Matrigel液滴易從孔底脫落；而 TeloCol^®-10液滴可穩(wěn)定黏附于孔中央。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：TeloCol^®‑10 是高通量 3D 生物打印的更優(yōu)選擇

在相同濃度下，TeloCol^®-10 與 Matrigel 均能支持乳腺癌細(xì)胞的球狀體形成與遷移，且細(xì)胞生長(zhǎng)速率基本一致。然而，Matrigel 在球狀體模型中培養(yǎng) 4 天后即出現(xiàn)明顯降解，在遷移模型中于第 6–7 天也發(fā)生降解；相比之下，TeloCol^®-10因保留端肽結(jié)構(gòu)而具有更高的剛度（1.2 kPa）和超過(guò) 99% 的純度，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)未出現(xiàn)任何降解跡象。同時(shí)，TeloCol^®-10 不含 Matrigel 中復(fù)雜的生長(zhǎng)因子及批次差異，因此更適用于高通量生物打印與長(zhǎng)期藥物篩選等應(yīng)用場(chǎng)景。

CELLCYTE X 在此次研究中發(fā)揮了關(guān)鍵作用：

高通量：支持 96 孔板全自動(dòng)并行監(jiān)測(cè)，適配大規(guī)模篩選需求；
長(zhǎng)時(shí)程：實(shí)現(xiàn)原位培養(yǎng)與連續(xù)成像，全程不干擾細(xì)胞正常狀態(tài)；
​定量化：內(nèi)置球狀體分析模塊，可快速完成對(duì)細(xì)胞聚集、遷移及生長(zhǎng)過(guò)程的量化評(píng)估。

未來(lái)展望

本研究通過(guò) 3D 生物打印結(jié)合 CELLCYTE X 活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像系統(tǒng)，成功構(gòu)建高通量乳腺癌細(xì)胞球狀體形成與遷移模型，并通過(guò)多維度驗(yàn)證了TeloCol^®-10相較于 Matrigel 在 3D 細(xì)胞培養(yǎng)中的優(yōu)勢(shì)。而 CELLCYTE X 憑借高通量并行監(jiān)測(cè)、長(zhǎng)時(shí)程非侵入式追蹤及多參數(shù)精準(zhǔn)量化分析技術(shù)，為3D模型的構(gòu)建質(zhì)控、動(dòng)態(tài)行為監(jiān)測(cè)及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的客觀評(píng)估提供了核心技術(shù)支撐，二者結(jié)合為腫瘤生物學(xué)研究、體外藥物篩選與高通量 3D 生物打印模型開(kāi)發(fā)，提供了更穩(wěn)定、可重復(fù)、更貼近生理環(huán)境的高效解決方案。