多通道電生理標測助力評估Man1a2敲低對抑郁模型中房顫發(fā)生的影響
研究背景：
抑郁癥是當代社會普遍且發(fā)病率上升的精神疾病，與心房顫動（AF）關聯(lián)密切，AF患者中抑郁癥患病率達38%-42.7%。流行病學研究均證實，抑郁癥是AF發(fā)病、新發(fā)生及復發(fā)的危險因素，也是導管消融術后AF復發(fā)的獨立危險因素。但兩者關聯(lián)機制尚不明確，目前僅知P2X7受體是連接因素。本研究基于無偏組學提出假設：抑郁狀態(tài)下腦白質分泌的N-棕櫚酰甘氨酸，通過Man1a2-AMPK-自噬-NRAP信號軸破壞心房閏盤，進而促進AF發(fā)生。
N-棕櫚酰甘氨酸由哺乳動物感覺神經元分泌，在組織器官中分布差異大，正常時皮膚和腦濃度最高，心臟含量極低，其生理功能尚未被充分探索。本研究發(fā)現(xiàn)，該物質可通過α1，2-甘露糖苷酶（Man1a2）作用于心肌閏盤，導致閏盤相關蛋白NRAP減少。Man1a2是參與真核蛋白N-糖鏈修飾的關鍵酶，其在內質網中的活性以劑量依賴方式決定錯誤折疊蛋白的降解途徑，局部濃度越高，蛋白錯誤折疊概率越大，而其在心肌組織中的作用此前未被報道。
基于此，哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院梁兆光教授團隊、董增祥教授團隊近期在Europace雜志上發(fā)表"N-palmitoyl glycine mediates depression-associated atrial fibrillation via Man1a2-dependent autophagy and NRAP dysregulation"文章。
研究結果：
1. 在CUMS誘導的抑郁大鼠中，AF的發(fā)生率增加
為驗證抑郁對房顫的影響，選用最常用、可靠且有效的慢性不可預知溫和應激（CUMS）嚙齒類抑郁模型。成功建立CUMS抑郁大鼠模型后，超聲心動圖評估顯示，抑郁大鼠左房舒張期內徑增大，E/E'升高。體表電生理檢測發(fā)現(xiàn)，抑郁大鼠心房有效不應期縮短，房顫誘導率升高。通過ELISA 檢測發(fā)現(xiàn)TNF-α表達升高。
圖1 在CUMS抑郁模型大鼠中，左心房直徑和心房顫動（AF）誘導率均有所增加
2. 在CUMS誘導的抑郁大鼠及伴發(fā)AF的抑郁癥患者中，腦白質分泌的血漿及心房組織N-棕櫚酰甘氨酸水平均升高
為識別作用于心臟的神經系統(tǒng)代謝物，對抑郁大鼠和對照大鼠血漿進行全譜代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)抑郁組代謝物中僅N-棕櫚酰甘氨酸由神經系統(tǒng)分泌。經LC-MS證實血漿中該物質由腦白質分泌。抑郁大鼠心房組織中該物質濃度也升高。臨床檢測顯示，伴房顫的抑郁癥患者血漿中N-棕櫚酰甘氨酸含量顯著高于單純抑郁癥患者。表明白質分泌的N-棕櫚酰甘氨酸在抑郁促發(fā)房顫中起重要作用。
圖2 在抑郁腦白質中分泌的過量N-棕櫚酰甘氨酸作用于心房肌細胞
3. 在抑郁大鼠中，NRAP的減少可導致心房閏盤破裂
為探究抑郁狀態(tài)下心房組織中促進房顫發(fā)生的蛋白變化，進行蛋白質組學檢測。差異蛋白富集分析顯示，調控蛋白定位至細胞表面的蛋白顯著富集，心肌閏盤相關蛋白亦顯著富集。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠心房肌閏盤破裂及肌漿網擴張。通過UniProt篩選出閏盤相關的NRAP表達下降最顯著。Western blotting及免疫熒光檢測均證實抑郁大鼠心房組織中NRAP表達顯著降低。
圖3 在CUMS模型中，NRAP的減少會導致心房閏盤破裂
4. 在抑郁大鼠的心房中，Man1a2的增加通過AMPK通路導致自噬水平降低
為探究NRAP減少機制，研究通過蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)，內質網與自噬相關降解途徑的差異蛋白中Man1a2表達增加。結合透射電鏡觀察，推測 Man1a2增加通過AMPK通路抑制自噬，致蛋白合成原料減少，進而阻礙NRAP合成。Western blot和免疫熒光檢測證實，抑郁大鼠心房組織中 Man1a2表達升高、AMPK激活且自噬水平降低。
圖4 抑郁大鼠心房中Man1a2的增加通過AMPK通路導致自噬水平降低
5. 在體外實驗中，N-棕櫚酰甘氨酸通過AMPK通路抑制自噬，進而增加Man1a2并減少NRAP
在HL-1心房肌細胞中，N-棕櫚酰甘氨酸濃度超20μM具細胞毒性，其可濃度依賴性升高Man1a2表達。Man1a2在內質網蛋白糖基化中起關鍵作用，其增加雖提升蛋白折疊效率，卻也提高錯誤折疊概率，按生理需求此時需自噬途徑降解蛋白。但實驗顯示，N-棕櫚酰甘氨酸會使Man1a2增加，同時抑制AMPK介導的自噬，致自噬原料減少，NRAP表達下降，細胞免疫熒光亦證實此現(xiàn)象。這提示，該物質可能通過此路徑促進房顫。
圖5 當將N-棕櫚酰甘氨酸添加到HL-1心房肌細胞中時，Man1a2表達增加，AMPK被激活，同時自噬水平和NRAP表達降低
6. 在體外和體內實驗中，敲低Man1a2可逆轉N-棕櫚酰甘氨酸所致的自噬水平降低及NRAP減少
研究通過體內外實驗證實，抑郁狀態(tài)下腦白質分泌的N-棕櫚酰甘氨酸進入血液，作用于心房組織，通過升高Man1a2表達激活AMPK信號通路，抑制自噬，導致閏盤相關蛋白NRAP表達下降，引起閏盤破裂，從而促進房顫發(fā)生。敲低Man1a2或激活自噬可逆轉這一過程，揭示了抑郁促發(fā)房顫的新機制。
圖6 在體外實驗中，敲低Man1a2后，N-棕櫚酰甘氨酸所致的自噬水平降低和NRAP減少得以逆轉
7. Man1a2可作為靶點，用于降低抑郁誘導的AF的發(fā)生
為檢測該通路對心房電活動的影響及是否通過交感 / 副交感神經作用，采用多通道電生理標測技術，檢測Langendorff灌流后離體心臟的場電位信號。結果顯示，抑郁大鼠房顫誘導率和持續(xù)時間顯著增加，而Man1a2敲低組則降低。此外，CUMS抑郁大鼠左房電傳導離散度顯著增加，敲低Man1a2后異常傳導降低。這表明Man1a2可作為降低抑郁模型中房顫發(fā)生的靶點。
圖7 在抑郁大鼠中敲低Man1a2可逆轉自噬水平及NRAP
本研究證實，N-棕櫚酰甘氨酸通過升高Man1a2表達，減少心房肌細胞中AMPK相關自噬及NRAP表達，進而導致閏盤破裂和心房興奮傳導離散度增加，從而促進房顫發(fā)生。綜上所述，本研究闡明了腦白質分泌的N-棕櫚酰甘氨酸在抑郁誘發(fā)房顫發(fā)病機制中的作用，為防治抑郁相關房顫提供了新靶點。
本文通過多通道電生理標測技術對不同組大鼠離體心臟的房顫誘發(fā)率、持續(xù)時間、有效不應期以及傳導離散度等指標進行檢測，直接評估Man1a2敲低對抑郁模型中房顫發(fā)生的影響。
