膠原蛋白的結構、分類及WB檢測中獲得理想條帶的關鍵
膠原蛋白是哺乳動物中是最重要的結構蛋白，也是細胞外基質（ECM）的主要成分。膠原蛋白在食品、化妝品、制藥和生物醫(yī)學行業(yè)中都有許多應用，同時與纖維性疾病息息相關。膠原蛋白及其他細胞外基質的過度沉積是器官纖維化的標志，纖維化會導致肺、肝、腎等器官的衰竭[1]。此外，膠原蛋白還與腫瘤形成有關，刺激原膠原賴氨酸作為膠原交聯(lián)劑的表達會增加膠原纖維的大小，促進癌癥擴散。而癌細胞中的膠原蛋白含量也影響其對化療的耐藥性[2]。研究膠原蛋白的結構特征及其在癌癥中的作用對于推進新的治療方法有積極的推動作用。然而在膠原蛋白的研究檢測中，大家常常會遇到這樣那樣的問題：WB實驗無條帶、分子量不正確……今天小優(yōu)細節(jié)君就和大家一起探討在WB檢測中怎么樣才能獲得理想的膠原蛋白條帶。
1 膠原蛋白結構與分類
膠原蛋白由三螺旋區(qū)和螺旋兩端的兩個非螺旋區(qū)組成。三螺旋構象是所有膠原的決定性結構元素（圖1a），膠原三螺旋（三級結構）具有由三條平行的α多肽鏈（二級結構）組成的螺旋狀結構，這些鏈以規(guī)則的螺旋相互纏繞，由氫鍵連接，形成繩狀結構（圖1b）[3]。
Fig. 1 膠原蛋白結構示意圖
迄今為止，人們已經發(fā)現(xiàn)了20多種不同類型的膠原蛋白，分別以羅馬數(shù)字命名為I型、II型、III型、IV型……其中，前五種膠原蛋白更易于提取，而I型膠原蛋白作為細胞外關鍵構成成分，在體內含量最為豐富，因此研究較多。
I型膠原蛋白的結構符合膠原蛋白家族的典型特征：含有一段(Gly-X-Y)n重復序列的三聚體結構，在C端與Ｎ端的２個前肽形成非螺旋區(qū)，位于(Gly-X-Y)n重復序列兩側，成為NC結構域。NC結構域可以進一步折疊成球狀結構。I型膠原蛋白分泌到胞外基質后，經剪切除去C與Ｎ-前肽，得到成熟的膠原蛋白。
2 檢測方法
通過前面的介紹，我們已經對膠原蛋白有了大致的了解，那么在進行WB實驗檢測膠原蛋白時有哪些需要特別注意的地方呢。有研究表明樣品的處理、凝膠的選擇都有可能對結果呈現(xiàn)產生影響，Victoria J. Iannarone就從上樣前處理、凝膠濃度等方面進行對比實驗，探究上樣前煮沸、是否加入BME以及SDS添加水平對于I型膠原蛋白檢測的影響，下面我們就一起來看一看。
首先檢測了完全不加入SDS的情況下，在8%Tris-甘氨酸凝膠、6%Tris-甘氨酸凝膠或4%–12%Tris-甘氨酸凝膠中不煮沸和無BME條件下的比目魚肌肉提取I型膠原蛋白（Fig2A的2泳道、Fig2B的2＆3泳道、Fig2C的5泳道），發(fā)現(xiàn)均可檢測到~240 kDa以上的條帶。
然后改變上樣前處理方式，上樣前煮沸并添加BME（Fig2C的2泳道），不煮沸但添加BME（Fig2C的3泳道），煮沸但不添加BME（Fig2C的4泳道）和不煮沸和不添加BME（Fig2C的5泳道），發(fā)現(xiàn)煮沸的樣本無論是否添加BME，泳道無內均無信號。而不煮沸時，不添加BME的樣本中信號強于添加BME的樣本。
Fig 2. 不同濃度凝膠檢測比目魚肌肉樣本I型膠原蛋白結果
前組結果展示了完全無SDS添加的條件下，I型膠原蛋白的檢測結果。接下來，改變SDS添加，分別使用含有或不含SDS的8%Tris-甘氨酸凝膠，檢測樣本中的I型膠原蛋白，并在樣品和電泳緩沖液中添加SDS，使蛋白部分變性，以期實現(xiàn)I型原膠原和成熟膠原檢測。
Fig3A與3B對比可以看出當僅在樣本及電泳液中添加SDS時，靶標條帶的呈現(xiàn)更加清晰單一，背景也更加干凈。
在凝膠中無SDS時，可以看出煮沸并添加BME使I型膠原蛋白信號完全喪失（Fig3B的2泳道）， 而僅添加BME或僅煮沸則可檢測到130kd以下的信號，代表變性和水解的膠原多肽[4]。同時，添加BME的樣本對于130kd以上前膠原的呈現(xiàn)更弱一些。
用BME煮沸時，相同的肌肉裂解物在~50kDa處顯示出微弱的膠原蛋白裂解產物帶（圖3A，泳道3），代表變性和水解的膠原蛋白多肽[13]。在泳道3的樣品中添加BME降低了檢測在泳道4和5中可觀察到的~130 kDa以上的前膠原條帶的能力，前膠原在非還原條件下更易檢出。
Fig 3. 不同SDS水平檢測比目魚肌肉和酸純化大鼠尾I型膠原蛋白結果(2-5為比目魚肌肉樣本，7-10為酸純化大鼠尾樣本)
為了進一步前膠原的實驗條件，換用4%–12%的不含SDS的Tris-甘氨酸凝膠以期獲得更好的分離效果。結果進一步驗證了前膠原在非還原條件下更易檢出（Fig4A的4、5、9、10泳道）。煮沸同時添加BME會導致肌肉裂解物中靶標信號丟失，而煮沸或添加BME則會使膠原裂解物增加（Fig4的3和4泳道）。
Fig 4. 4-20%不含SDS凝膠檢測比目魚肌肉和酸純化大鼠尾I型膠原蛋白結果(2-5為比目魚肌肉樣本，7-10為酸純化大鼠尾樣本)
綜合上述結果，我們可以發(fā)現(xiàn)I型前膠原在適當變性（凝膠中無SDS、樣品及buffer中添加SDS）、非還原（不煮沸、不添加BME）條件下更容易檢出，I型膠原成熟體在適當變性、以及添加BME（不煮沸）條件下更容易檢出。
當然在針對具體樣本的檢測時可能也會有不一樣的結果呈現(xiàn)，在進行I型膠原蛋白的檢測時，可以參考上述條件，選擇合適的方式進行檢測。同時也啟發(fā)我們在進行其他實驗時，也可以根據(jù)實際的研究目的以及樣本的特性，有選擇地調整相關實驗條件，從而更好的呈現(xiàn)研究結果。
部分產品推薦：
參考文獻：
[1] Zuo S, Wang B, Liu J, Kong D, Cui H, Jia Y, Wang C, Xu X, Chen G, Wang Y, Yang L, Zhang K, Ai D, Du J, Shen Y, Yu Y. ER-anchored CRTH2 antagonizes collagen biosynthesis and organ fibrosis via binding LARP6. EMBO J. 2021 Aug 16;40(16):e107403. doi: 10.15252/embj.2020107403. Epub 2021 Jul 5. PMID: 34223653; PMCID: PMC8365266.
[2] Angre T, Kumar A, Singh AK, Thareja S, Kumar P. Role of Collagen Regulators in Cancer Treatment: A Comprehensive Review. Anticancer Agents Med Chem. 2022;22(17):2956-2984. doi: 10.2174/1871520622666220501162351. PMID: 35490431.
[3] Sorushanova A, Delgado LM, Wu Z, Shologu N, Kshirsagar A, Raghunath R, Mullen AM, Bayon Y, Pandit A, Raghunath M, Zeugolis DI. The Collagen Suprafamily: From Biosynthesis to Advanced Biomaterial Development. Adv Mater. 2019 Jan;31(1):e1801651. doi: 10.1002/adma.201801651. Epub 2018 Aug 20. PMID: 30126066.
[4] Gorgieva S, Kokol V (2011) Collagen- vs. gelatine-based biomaterials and their biocompatibility: Review and perspectives. IntechOpen. doi: 10.5772/24118.
[2] Role of Collagen Regulators in Cancer Treatment: A Comprehensive Review
PMID: 35490431
DOI: 10.2174/1871520622666220501162351
[3] The Collagen Suprafamily: From Biosynthesis to Advanced Biomaterial Development
PMID: 30126066
DOI: 10.1002/adma.201801651
[4] Gorgieva S, Kokol V (2011) Collagen- vs. gelatine-based biomaterials and their biocompatibility: Review and perspectives. IntechOpen.
doi: 10.5772/24118.
1 膠原蛋白結構與分類
膠原蛋白由三螺旋區(qū)和螺旋兩端的兩個非螺旋區(qū)組成。三螺旋構象是所有膠原的決定性結構元素（圖1a），膠原三螺旋（三級結構）具有由三條平行的α多肽鏈（二級結構）組成的螺旋狀結構，這些鏈以規(guī)則的螺旋相互纏繞，由氫鍵連接，形成繩狀結構（圖1b）[3]。
Fig. 1 膠原蛋白結構示意圖
迄今為止，人們已經發(fā)現(xiàn)了20多種不同類型的膠原蛋白，分別以羅馬數(shù)字命名為I型、II型、III型、IV型……其中，前五種膠原蛋白更易于提取，而I型膠原蛋白作為細胞外關鍵構成成分，在體內含量最為豐富，因此研究較多。
I型膠原蛋白的結構符合膠原蛋白家族的典型特征：含有一段(Gly-X-Y)n重復序列的三聚體結構，在C端與Ｎ端的２個前肽形成非螺旋區(qū)，位于(Gly-X-Y)n重復序列兩側，成為NC結構域。NC結構域可以進一步折疊成球狀結構。I型膠原蛋白分泌到胞外基質后，經剪切除去C與Ｎ-前肽，得到成熟的膠原蛋白。
2 檢測方法
通過前面的介紹，我們已經對膠原蛋白有了大致的了解，那么在進行WB實驗檢測膠原蛋白時有哪些需要特別注意的地方呢。有研究表明樣品的處理、凝膠的選擇都有可能對結果呈現(xiàn)產生影響，Victoria J. Iannarone就從上樣前處理、凝膠濃度等方面進行對比實驗，探究上樣前煮沸、是否加入BME以及SDS添加水平對于I型膠原蛋白檢測的影響，下面我們就一起來看一看。
首先檢測了完全不加入SDS的情況下，在8%Tris-甘氨酸凝膠、6%Tris-甘氨酸凝膠或4%–12%Tris-甘氨酸凝膠中不煮沸和無BME條件下的比目魚肌肉提取I型膠原蛋白（Fig2A的2泳道、Fig2B的2＆3泳道、Fig2C的5泳道），發(fā)現(xiàn)均可檢測到~240 kDa以上的條帶。
然后改變上樣前處理方式，上樣前煮沸并添加BME（Fig2C的2泳道），不煮沸但添加BME（Fig2C的3泳道），煮沸但不添加BME（Fig2C的4泳道）和不煮沸和不添加BME（Fig2C的5泳道），發(fā)現(xiàn)煮沸的樣本無論是否添加BME，泳道無內均無信號。而不煮沸時，不添加BME的樣本中信號強于添加BME的樣本。
Fig 2. 不同濃度凝膠檢測比目魚肌肉樣本I型膠原蛋白結果
前組結果展示了完全無SDS添加的條件下，I型膠原蛋白的檢測結果。接下來，改變SDS添加，分別使用含有或不含SDS的8%Tris-甘氨酸凝膠，檢測樣本中的I型膠原蛋白，并在樣品和電泳緩沖液中添加SDS，使蛋白部分變性，以期實現(xiàn)I型原膠原和成熟膠原檢測。
Fig3A與3B對比可以看出當僅在樣本及電泳液中添加SDS時，靶標條帶的呈現(xiàn)更加清晰單一，背景也更加干凈。
在凝膠中無SDS時，可以看出煮沸并添加BME使I型膠原蛋白信號完全喪失（Fig3B的2泳道）， 而僅添加BME或僅煮沸則可檢測到130kd以下的信號，代表變性和水解的膠原多肽[4]。同時，添加BME的樣本對于130kd以上前膠原的呈現(xiàn)更弱一些。
用BME煮沸時，相同的肌肉裂解物在~50kDa處顯示出微弱的膠原蛋白裂解產物帶（圖3A，泳道3），代表變性和水解的膠原蛋白多肽[13]。在泳道3的樣品中添加BME降低了檢測在泳道4和5中可觀察到的~130 kDa以上的前膠原條帶的能力，前膠原在非還原條件下更易檢出。
Fig 3. 不同SDS水平檢測比目魚肌肉和酸純化大鼠尾I型膠原蛋白結果(2-5為比目魚肌肉樣本，7-10為酸純化大鼠尾樣本)
為了進一步前膠原的實驗條件，換用4%–12%的不含SDS的Tris-甘氨酸凝膠以期獲得更好的分離效果。結果進一步驗證了前膠原在非還原條件下更易檢出（Fig4A的4、5、9、10泳道）。煮沸同時添加BME會導致肌肉裂解物中靶標信號丟失，而煮沸或添加BME則會使膠原裂解物增加（Fig4的3和4泳道）。
Fig 4. 4-20%不含SDS凝膠檢測比目魚肌肉和酸純化大鼠尾I型膠原蛋白結果(2-5為比目魚肌肉樣本，7-10為酸純化大鼠尾樣本)
綜合上述結果，我們可以發(fā)現(xiàn)I型前膠原在適當變性（凝膠中無SDS、樣品及buffer中添加SDS）、非還原（不煮沸、不添加BME）條件下更容易檢出，I型膠原成熟體在適當變性、以及添加BME（不煮沸）條件下更容易檢出。
當然在針對具體樣本的檢測時可能也會有不一樣的結果呈現(xiàn)，在進行I型膠原蛋白的檢測時，可以參考上述條件，選擇合適的方式進行檢測。同時也啟發(fā)我們在進行其他實驗時，也可以根據(jù)實際的研究目的以及樣本的特性，有選擇地調整相關實驗條件，從而更好的呈現(xiàn)研究結果。
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參考文獻：
[1] Zuo S, Wang B, Liu J, Kong D, Cui H, Jia Y, Wang C, Xu X, Chen G, Wang Y, Yang L, Zhang K, Ai D, Du J, Shen Y, Yu Y. ER-anchored CRTH2 antagonizes collagen biosynthesis and organ fibrosis via binding LARP6. EMBO J. 2021 Aug 16;40(16):e107403. doi: 10.15252/embj.2020107403. Epub 2021 Jul 5. PMID: 34223653; PMCID: PMC8365266.
[2] Angre T, Kumar A, Singh AK, Thareja S, Kumar P. Role of Collagen Regulators in Cancer Treatment: A Comprehensive Review. Anticancer Agents Med Chem. 2022;22(17):2956-2984. doi: 10.2174/1871520622666220501162351. PMID: 35490431.
[3] Sorushanova A, Delgado LM, Wu Z, Shologu N, Kshirsagar A, Raghunath R, Mullen AM, Bayon Y, Pandit A, Raghunath M, Zeugolis DI. The Collagen Suprafamily: From Biosynthesis to Advanced Biomaterial Development. Adv Mater. 2019 Jan;31(1):e1801651. doi: 10.1002/adma.201801651. Epub 2018 Aug 20. PMID: 30126066.
[4] Gorgieva S, Kokol V (2011) Collagen- vs. gelatine-based biomaterials and their biocompatibility: Review and perspectives. IntechOpen. doi: 10.5772/24118.
[2] Role of Collagen Regulators in Cancer Treatment: A Comprehensive Review
PMID: 35490431
DOI: 10.2174/1871520622666220501162351
[3] The Collagen Suprafamily: From Biosynthesis to Advanced Biomaterial Development
PMID: 30126066
DOI: 10.1002/adma.201801651
[4] Gorgieva S, Kokol V (2011) Collagen- vs. gelatine-based biomaterials and their biocompatibility: Review and perspectives. IntechOpen.
doi: 10.5772/24118.
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