胞外基質(zhì)（ECM）作為細(xì)胞賴以生存的外界微環(huán)境，不僅為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支撐，還通過(guò)與細(xì)胞表面受體的相互作用調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移等關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程。在細(xì)胞生物學(xué)研究中，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的溫和解離、組織器官中細(xì)胞的精準(zhǔn)分離是開展實(shí)驗(yàn)的前提。Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）作為一種具有獨(dú)特底物特異性的中性金屬蛋白酶，能夠在保持細(xì)胞活性的前提下，選擇性降解細(xì)胞外基質(zhì)中的纖維連接蛋白、層粘連蛋白等關(guān)鍵成分，同時(shí)避免對(duì)細(xì)胞表面的蛋白造成過(guò)度損傷。因此，Neutral Protease II在原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)、組織器官中的細(xì)胞解離以及類器官研究中有著廣泛的應(yīng)用。AbMole為全球科研客戶提供高純度、高生物活性的抑制劑、細(xì)胞因子、人源單抗、天然產(chǎn)物、熒光染料、多肽、化合物庫(kù)、抗生素等科研試劑，全球大量文獻(xiàn)專利引用。

一、Neutral Protease II的作用機(jī)理
Neutral Protease II （中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）是一種源自芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）的M4 家族金屬蛋白酶，其成熟肽鏈由約480個(gè)氨基酸殘基組成，Neutral Protease II 的三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)典型的 “沙漏型” 折疊，核心區(qū)域包含一個(gè)由鋅離子、兩個(gè)組氨酸（His）和一個(gè)谷氨酸（Glu）組成的活性中心，即 “HEXXH” 保守序列，這一結(jié)構(gòu)是金屬蛋白酶催化底物水解的關(guān)鍵位點(diǎn)。Neutral Protease II 具有嚴(yán)格的底物選擇性，主要作用于細(xì)胞外基質(zhì)中的纖維連接蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白 IV 型等非纖維狀膠原成分，對(duì) I 型、II 型等纖維狀膠原的降解活性較低。其底物識(shí)別位點(diǎn)通常為含有亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）等疏水氨基酸殘基的肽鍵，尤其偏好水解位于疏水性氨基酸 C 端的肽鍵，這種特異性使其能夠精準(zhǔn)解離細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的連接，而對(duì)細(xì)胞間直接連接（如緊密連接、橋粒）的影響較小。Neutral Protease II 的最適 pH 值范圍為 7.0-8.0，屬于中性蛋白酶，在生理 pH 環(huán)境下可保持較高的催化活性，Neutral Protease II 的最適反應(yīng)溫度為 37℃，與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溫度一致，進(jìn)一步提升了其在細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)中的適用性。此外，Neutral Protease II 的活性依賴于鋅離子的存在，EDTA 等金屬離子螯合劑可通過(guò)螯合鋅離子顯著抑制Neutral Protease II 的活性，而 Ca²⁺則對(duì)該酶的穩(wěn)定性具有一定的促進(jìn)作用，在反應(yīng)體系中添加適量 Ca²⁺可延長(zhǎng)其活性維持時(shí)間。

二、Neutral Protease II在科研領(lǐng)域中的應(yīng)用
1. Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II）用于原代細(xì)胞分離
原代細(xì)胞因其保留了體內(nèi)細(xì)胞的生物學(xué)特性，在細(xì)胞功能研究、藥物篩選模型的構(gòu)建等領(lǐng)域具有不可替代的作用。然而，組織中的細(xì)胞被大量胞外基質(zhì)包裹，傳統(tǒng)的機(jī)械研磨或胰蛋白酶消化方法往往存在細(xì)胞活性低、分離效率差等問(wèn)題。Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）憑借其溫和的解離特性，已成為多種組織原代細(xì)胞分離的首選工具酶之一。例如，在小鼠乳腺上皮細(xì)胞的分離中，將乳腺組織剪碎后用 Neutral Protease II在 37℃下孵育 1-2 小時(shí)，可有效降解乳腺組織中的細(xì)胞外基質(zhì)，使上皮細(xì)胞團(tuán)從間質(zhì)組織中分離，后續(xù)再聯(lián)合Collagenase I 消化，即可獲得高活性的乳腺上皮單細(xì)胞懸液^{[1, 2]}。類似地，在神經(jīng)干細(xì)胞的分離中，Neutral Protease II 可用于從胼胝骨下方區(qū)域分離出神經(jīng)干細(xì)胞。相較于胰蛋白酶，Neutral Protease II 能更好地保留神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新能力和分化潛能，分離得到的細(xì)胞在體外培養(yǎng)體系中可形成更多的神經(jīng)球，且向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分化的比例更高^[3]。2014年，AbMole的兩款抑制劑分別被西班牙國(guó)家心血管研究中心和美國(guó)哥倫比亞大學(xué)用于動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，相關(guān)科研成果發(fā)表于頂刊 Nature 和 Nature Medicine。

圖 1. 利用Neutral Protease II從胼胝骨下區(qū)分離出神經(jīng)干細(xì)胞并形成神經(jīng)球^[3]

2. Neutral Protease II用于貼壁細(xì)胞傳代
對(duì)于某些貼壁生長(zhǎng)能力較強(qiáng)的細(xì)胞系（如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞），傳統(tǒng)的胰蛋白酶消化法可能導(dǎo)致細(xì)胞表面蛋白損傷，影響細(xì)胞的后續(xù)生長(zhǎng)和功能。Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）可通過(guò)特異性降解細(xì)胞與培養(yǎng)皿表面之間的細(xì)胞外基質(zhì)成分（如纖維連接蛋白），實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的溫和解離。在實(shí)際操作中，將 Neutral Protease II 溶液加入培養(yǎng)皿中，37℃孵育數(shù)分鐘后，細(xì)胞即可從培養(yǎng)皿表面脫落，且細(xì)胞聚集體較小，輕輕吹打即可分散，這可降低細(xì)胞機(jī)械損傷的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，使用 Neutral Protease II 傳代的人皮膚成纖維細(xì)胞，其細(xì)胞活力和生長(zhǎng)狀態(tài)要優(yōu)于傳統(tǒng)胰蛋白酶和EDTA消化的細(xì)胞，這表明Neutral Protease II 對(duì)某些細(xì)胞的生理功能影響更小^[4]。

3. Neutral Protease II用于組織器官解離
隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，獲取高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液成為該技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵前提。對(duì)于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的組織器官（如肝臟、腎臟、肺臟），Neutral Protease II （中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）常與其他酶，如膠原酶（Collagenase II，AbMole，M9973）、透明質(zhì)酸酶（Hyaluronidase，AbMole，M9941）聯(lián)合使用，構(gòu)建高效的組織解離方案。以肌肉和骨骼組織為例，Neutral Protease II可聯(lián)合Collagenase I（膠原酶 I ） 、Collagenase II（膠原酶II） 、Pronase 等酶從上述組織中分離出包括間充質(zhì)干細(xì)胞、骨譜系細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的單細(xì)胞混合群，這為單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)提供了基礎(chǔ)^[5]。

圖 2. 來(lái)自不同肌肉骨骼組織的單細(xì)胞分離方案示意圖^[5]

4. Neutral Protease II用于三維細(xì)胞培養(yǎng)與類器官構(gòu)建
類器官培養(yǎng)技術(shù)能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)微環(huán)境，更真實(shí)地反映細(xì)胞的生物學(xué)行為。在類器官（包括腫瘤類器官、胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的類器官）培養(yǎng)中，細(xì)胞一般接種于基質(zhì)膠等三維支架中。如何從基質(zhì)膠有效回收類器官細(xì)胞且不影響細(xì)胞的生物學(xué)參數(shù)，是類器官培養(yǎng)中的關(guān)鍵問(wèn)題。Neutral Protease II（中性蛋白酶II，分散酶II，AbMole，M21672）可用于類器官中的基質(zhì)膠降解和類器官的消化傳代。

圖 3. Dispase與其它基質(zhì)膠降方法的比較^[6]

AbMole是ChemBridge中國(guó)區(qū)官方指定合作伙伴。

參考文獻(xiàn)及鳴謝
[1] John Stingl, Joanne T. Emerman, Connie J. Eaves, Enzymatic Dissociation and Culture of Normal Human Mammary Tissue to Detect Progenitor Activity, in: C.D. Helgason, C.L. Miller (Eds.), Basic Cell Culture Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, 2005, pp. 249-263.
[2] Rana Mroue, Mina J. Bissell, Three-Dimensional Cultures of Mouse Mammary Epithelial Cells, in: S.H. Randell, M.L. Fulcher (Eds.), Epithelial Cell Culture Protocols: Second Edition, Humana Press, Totowa, NJ, 2013, pp. 221-250.
[3] J. Y. Kim, J. H. Lee, W. Sun, Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone, Journal of visualized experiments : JoVE (118) (2016).
[4] J. J. Cassiman, M. Brugmans, H. Van den Berghe, Growth and surface properties of dispase dissociated human fibroblasts, Cell Biology International Reports 5(2) (1981) 125-132.
[5] Manman Gao, Peng Guo, Xizhe Liu, et al., Systematic study of single-cell isolation from musculoskeletal tissues for single-sell sequencing, BMC Molecular and Cell Biology 23(1) (2022) 32.
[6] M. Wang, H. Yu, T. Zhang, et al., In-Depth Comparison of Matrigel Dissolving Methods on Proteomic Profiling of Organoids, Molecular & cellular proteomics : MCP 21(1) (2022) 100181.