細胞計數(shù)儀在單細胞測序中進行準確計數(shù)和樣品質量驗證的應用優(yōu)勢
利用細胞計數(shù)儀在單細胞測序中評估細胞
概述單細胞測序技術能夠用來表征異常細胞群，分析稀有細胞和細胞圖譜網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)異質性等。由于單細胞測序巨大的應用潛力，目前此技術正在經(jīng)歷爆炸性增長。然而，單細胞測序需要成本和時間的大量投資。為了確保時間和資源的投資得到高質量的數(shù)據(jù)回報，處理前的樣本質量至關重要。此外，由于所有的單細胞測序方案都依賴于在處理前準確定量細胞，因此準確的細胞計數(shù)是非常重要的第一步。
因此，用于定量單細胞測序樣品的自動細胞計數(shù)儀必須準確可靠地對所有樣品類型的細胞進行計數(shù)，包括分離的組織、分離的細胞核、全血和培養(yǎng)的細胞系。在此，我們演示了LUNA-FX7自動細胞計數(shù)儀如何為不同類型的樣品提供準確的計數(shù)和樣品質量的驗證。
單細胞測序工作流程：1) 組織收集，2) 分離細胞制備，3) 測序文庫制備，4) 測序和 5) 分析。
細胞樣本質量評估
最初收集了兩個細胞樣本用于單細胞測序分析。兩個樣本均使用標準細胞活力方案和AO/PI細胞染色染料進行計數(shù)。第一個樣品是從人外周血中分離出的B細胞，具有高度的活力和單細胞分離度，適合下游文庫制備。
B細胞為單細胞文庫做好了充分準備，包括所有陽性綠色細胞，沒有死細胞（RF）或顆粒碎片(BF)，具有100%活力。這些健康細胞的平均大小為10.7 μm，在細胞計數(shù)時濃度為3.00E+05個細胞/ml的細胞簇圖中的單細胞分離率為100%。
相比之下，第二個樣品（貼壁AsPC-1細胞）提供了一個示例，說明基于圖像的準確計數(shù)器對于評估樣品制備的數(shù)量和質量至關重要。收獲后，AsPC-1細胞發(fā)生不完全解離。生成的圖像清楚地顯示，很大一部分細胞內容物仍被納入結合的簇中，高達9%，而AsPC-1的活力僅為56%。根據(jù)活力和細胞分離情況，該樣品不適合下游處理。在許多情況下，單細胞的樣品細胞是有限的，需要低細胞濃度和重復計數(shù)才能獲得最佳和快速的細胞計數(shù)。在低細胞濃度的精確計數(shù)中，我們使用LUNA 1通道載玻片，它可以容納更大的細胞體積，即使細胞濃度低至1.00E+04個細胞/ml也可以進行計數(shù)。
用于單細胞測序的細胞樣品制備不充分的示例。“失敗的“AsPC-1細胞制備顯示死細胞含量高且含有不完全解離的細胞簇。LUNA-FX7的簇直方圖功能可以準確評估細胞簇百分比與分離細胞的百分比。
分析完整的細胞核
對于一些單細胞測序應用，分離的細胞需要進一步處理以產(chǎn)生分離且完整的細胞核。接下來我們評估了LUNA-FX7的實用性，以評估完全分離的細胞核的整體質量和數(shù)量。為此，我們使用了3種細胞系-HL60、HeLa細胞和HEK細胞。下圖顯示了包含完整健康HL60細胞（左）、細胞核部分分離的HL60細胞（中）和細胞核完全分離（右）的3幅圖像，并且具有完整細胞膜的活細胞通過AO染色后呈現(xiàn)綠色熒光。相比之下，死細胞和分離的細胞核都因通過缺損或缺失的細胞膜吸收PI而呈現(xiàn)紅色熒光。然而，LUNA-FX7允許您使用大小信息區(qū)分完整的死細胞和完整的細胞核。例如，完整活體的HL-60的平均細胞大小為13.4微米，完全分離的細胞核的平均大小為8.3微米，表明細胞膜和血漿部分被成功去除。未完全分離的核尺寸經(jīng)測量平均為10.2 μm，表明分離核的質量不足以進行下游處理。
HL 60細胞的細胞核分離過程的可能結果。明場(BF)圖像和帶標簽的疊加熒光圖像可讓您輕松區(qū)分不同的細胞“狀態(tài)”。在BF圖像中，完整的細胞明顯比分離的細胞核更突出、更暗。同時，熒光圖像和計數(shù)可以實現(xiàn)準確的定量評估。
此外，LUNA-FX7的高分辨率明場圖像可用于目視驗證分離核的質量。例如，分離的細胞核可以很容易地與完整細胞區(qū)分開來，因為細胞核的邊界更薄，并且由于缺乏細胞膜而不明顯。
區(qū)分活核、死核和完整核。由于死細胞和完整的細胞核都缺乏完整的細胞膜，因此從碘化丙啶染色中可以看到紅色熒光。LUNA-FX7生成的BF圖像和尺寸測量可以常規(guī)地區(qū)分死細胞和完整的分離細胞核。
總之，LUNA-FX7在三通道成像（BF、GF和RF）方面的功能和靈敏度，以及復雜的標記算法，使您可以在進行昂貴的下游處理之前建立樣品通過與否的質量控制標準。
評估分離的核和可能的結果。明場(BF)圖像和疊加熒光圖像可讓您輕松區(qū)分不同的細胞“狀態(tài)”。在BF 圖像中，完整的細胞比孤立的細胞核顯得明顯更突出、邊界更暗。同時，熒光圖像和計數(shù)可以實現(xiàn)準確的定量評估�；畹耐暾毎眠灌こ�(GF)染色，分離的細胞核被染成紅色。LUNA-FX7可以準確區(qū)分細胞質大、細胞核小(HeLa)的樣品以及細胞核相對于細胞質較大的細胞類型(HEK293)。
結論
對于單細胞測序，LUNA-FX7為探索提高細胞樣本準確性和可靠性的研究人員提供了見解，以評估各種樣本類型中的細胞和分離的細胞核樣本的數(shù)量和質量。
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