多維度電生理技術助力構建全球首個長QT綜合征的基因編輯小型豬模型
近日，浙江大學動物科學學院莊樂南研究員、浙江大學轉化醫(yī)學研究院梁平教授及中國農業(yè)大學杜旭光教授帶領的聯合團隊，在國際心血管領域頂級期刊《Circulation》（IF=38.6）上發(fā)表了題為“Modeling Long-QT Syndrome Using Gene-Edited Miniature Pigs”的研究論文。該項目獲得河南省斯高電生理研究院（斯高研究院）和河南省醫(yī)學科學院電生理研究所（電生理所）的深度協作與關鍵支撐。
該文章主要有兩大亮點：
第一，構建全球首個長QT綜合征的基因編輯小型豬模型；
第二，通過無創(chuàng)生理信號遙測系統(tǒng)、電標測、光標測等多維度電生理技術的聯合應用，為大動物模型的心電表型驗證、病理機制解析及藥物治療驗證提供了經典范式。斯高研究院和電生理所共同完成了電生理相關研究工作。
2型長QT綜合征（LQT2）是一種由KCNH2基因功能缺失突變引起的遺傳性心律失常疾病，臨床表現包括QT間期延長，并易引發(fā)心源性猝死等惡性心臟事件。KCNH2基因編碼心肌電壓門控鉀通道hERG的α亞基，該通道負責產生延遲整流鉀電流（IKr），對心肌復極至關重要。由于人類原代心肌組織難以獲取，目前研究多依賴轉染細胞模型或動物模型。然而，IKr在人類心室肌復極中起主導作用，而在嚙齒類動物中抑制IKr對復極影響不顯著，因此構建能夠準確模擬人類LQT2病理特征的大動物模型成為迫切需求。
該研究成功構建全球首個KCNH2基因敲除的長QT綜合征小型豬模型，系統(tǒng)模擬了人類LQT2的臨床與病理表型，為疾病機制解析與藥物研發(fā)提供了重要平臺。
研究團隊運用 CRISPR-Cas9 基因編輯技術，結合體細胞核移植和胚胎移植，成功獲得國際首個KCNH2基因敲除的長QT綜合征小型豬模型，構建流程如下：（圖 1）
圖1. 基因編輯豬構建流程
利用這一模型，研究團隊對 1 頭清醒、無束縛狀態(tài)的野生型小型豬和 1 頭基因突變小型豬進行 24 小時心電圖持續(xù)監(jiān)測（無創(chuàng)生理信號遙測系統(tǒng)，設備品牌：MappingLab），結果顯示突變豬表現出 QT 間期延長、T 波異常及 QT 離散度增加，與人類 LQT2 的表型高度相似，并記錄到自發(fā)性尖端扭轉型室速等惡性心律失常事件，相關檢測結果通過圖 2 呈現，包括 42 月齡野生型與基因突變豬的心電圖、兩者 Bazett 校正 QT 間期（QTCB）柱狀圖、QT/RR 關系散點圖及線性回歸（實線為擬合線）、QT 間期 Poincaré 散點圖（野生型置信區(qū)間面積 4.68，基因突變豬 7.56），以及 9 月齡基因突變豬動態(tài)心電圖記錄的自發(fā)性尖端扭轉型室速。
圖2. 基因突變豬心電異常
圖3. 在體誘導室速實驗結果
為了研究基因突變豬離子通道的改變，利用光標測技術（Optical Mapping; 設備品牌：MappingLab）發(fā)現，與野生型豬相比，基因突變豬表現出明顯的室間復極化延長與傳導延遲，相關實驗結果見圖 4，左上圖為電壓敏感染料標測的右心室組織塊時間傳導圖及動作電位復極 80% 時程（APD80），清晰呈現基因突變豬復極延長、傳導延遲的特征；右上圖為不同基礎周期長度（BCL）下 APD80 點圖；左下圖為不同 BCL 下 APD30/APD80 點圖；右下圖為鈣敏感染料標測的鈣瞬變傳導時長及回收 80% 時長圖，紅色箭頭指示基因突變豬鈣瞬變暫停現象。
圖4. 光標測實驗結果
此外，研究還發(fā)現基因突變豬心臟出現鈣瞬變異常，研究人員使用鈣離子阻斷劑地爾硫卓進行干預，證實其可緩解鈣瞬變暫停與動作電位時程延長，首次通過實驗驗證鈣通道阻滯劑可能減少 LQT2 患者的惡性心律不齊事件，相關干預效果見圖 5，左上圖為不同濃度地爾硫卓處理后右心室組織塊鈣瞬變時長圖，可見 10μM 地爾硫卓可恢復基因突變豬鈣瞬變暫停；右上圖為鈣瞬變峰值點圖；左下圖為動作電位代表圖；右下圖為 APD30/APD50/APD80 比較線圖，顯示 30μM 地爾硫卓可使基因突變豬 APD 恢復至野生型基線水平。
圖5. 地爾硫卓干預實驗結果
圖6. 膜片鉗實驗結果
單核轉錄組測序進一步揭示，突變豬心肌組織中鉀、鈣離子通道失衡，并伴有代謝水平下降與炎癥通路激活，為深入理解LQT2的復雜病理機制提供了新視角（圖7）。
圖7. 單細胞核轉錄組測序結果
綜上，本研究成功構建全球首個能夠高度模擬人類LQT2的基因編輯小型豬模型。相較于現有的長 QT 綜合征小動物模型，該大動物模型的建立是一項重大突破，為 LQT2 的基因治療研究和臨床前藥物篩選提供了極高的應用價值。鑒于 hERG 通道既是心律失常藥物治療的核心靶點，又與獲得性長 QT 綜合征密切相關，此模型具備廣泛的科研與臨床應用前景。
該文章主要有兩大亮點：
第一，構建全球首個長QT綜合征的基因編輯小型豬模型；
第二，通過無創(chuàng)生理信號遙測系統(tǒng)、電標測、光標測等多維度電生理技術的聯合應用，為大動物模型的心電表型驗證、病理機制解析及藥物治療驗證提供了經典范式。斯高研究院和電生理所共同完成了電生理相關研究工作。
2型長QT綜合征（LQT2）是一種由KCNH2基因功能缺失突變引起的遺傳性心律失常疾病，臨床表現包括QT間期延長，并易引發(fā)心源性猝死等惡性心臟事件。KCNH2基因編碼心肌電壓門控鉀通道hERG的α亞基，該通道負責產生延遲整流鉀電流（IKr），對心肌復極至關重要。由于人類原代心肌組織難以獲取，目前研究多依賴轉染細胞模型或動物模型。然而，IKr在人類心室肌復極中起主導作用，而在嚙齒類動物中抑制IKr對復極影響不顯著，因此構建能夠準確模擬人類LQT2病理特征的大動物模型成為迫切需求。
該研究成功構建全球首個KCNH2基因敲除的長QT綜合征小型豬模型，系統(tǒng)模擬了人類LQT2的臨床與病理表型，為疾病機制解析與藥物研發(fā)提供了重要平臺。
研究團隊運用 CRISPR-Cas9 基因編輯技術，結合體細胞核移植和胚胎移植，成功獲得國際首個KCNH2基因敲除的長QT綜合征小型豬模型，構建流程如下：（圖 1）
圖1. 基因編輯豬構建流程
利用這一模型，研究團隊對 1 頭清醒、無束縛狀態(tài)的野生型小型豬和 1 頭基因突變小型豬進行 24 小時心電圖持續(xù)監(jiān)測（無創(chuàng)生理信號遙測系統(tǒng)，設備品牌：MappingLab），結果顯示突變豬表現出 QT 間期延長、T 波異常及 QT 離散度增加，與人類 LQT2 的表型高度相似，并記錄到自發(fā)性尖端扭轉型室速等惡性心律失常事件，相關檢測結果通過圖 2 呈現，包括 42 月齡野生型與基因突變豬的心電圖、兩者 Bazett 校正 QT 間期（QTCB）柱狀圖、QT/RR 關系散點圖及線性回歸（實線為擬合線）、QT 間期 Poincaré 散點圖（野生型置信區(qū)間面積 4.68，基因突變豬 7.56），以及 9 月齡基因突變豬動態(tài)心電圖記錄的自發(fā)性尖端扭轉型室速。
圖2. 基因突變豬心電異常
團隊進一步將豬麻醉開胸后，通過電標測技術（Electrical Mapping; 設備品牌：MappingLab）記錄在體誘導室速實驗，結果顯示相同刺激條件下，野生型豬心臟被成功起搏，刺激停止后立即恢復為正常的竇性心律，而基因突變豬則誘發(fā)出強烈室顫，刺激停止后的傳導圖出現多個波裂，提示其心室復極不均一，易發(fā)惡性心律失常，圖 3 左圖為麻醉狀態(tài)下野生型與基因突變豬經短陣快速刺激（S1S1）誘導的心電圖（基因突變豬出現持續(xù)性室顫），右圖為傳導圖，展示了刺激前基礎竇性心律、野生型刺激后竇性心律及基因突變豬刺激后心律失常的心臟傳導特征。
圖3. 在體誘導室速實驗結果
為了研究基因突變豬離子通道的改變，利用光標測技術（Optical Mapping; 設備品牌：MappingLab）發(fā)現，與野生型豬相比，基因突變豬表現出明顯的室間復極化延長與傳導延遲，相關實驗結果見圖 4，左上圖為電壓敏感染料標測的右心室組織塊時間傳導圖及動作電位復極 80% 時程（APD80），清晰呈現基因突變豬復極延長、傳導延遲的特征；右上圖為不同基礎周期長度（BCL）下 APD80 點圖；左下圖為不同 BCL 下 APD30/APD80 點圖；右下圖為鈣敏感染料標測的鈣瞬變傳導時長及回收 80% 時長圖，紅色箭頭指示基因突變豬鈣瞬變暫停現象。
圖4. 光標測實驗結果
此外，研究還發(fā)現基因突變豬心臟出現鈣瞬變異常，研究人員使用鈣離子阻斷劑地爾硫卓進行干預，證實其可緩解鈣瞬變暫停與動作電位時程延長，首次通過實驗驗證鈣通道阻滯劑可能減少 LQT2 患者的惡性心律不齊事件，相關干預效果見圖 5，左上圖為不同濃度地爾硫卓處理后右心室組織塊鈣瞬變時長圖，可見 10μM 地爾硫卓可恢復基因突變豬鈣瞬變暫停；右上圖為鈣瞬變峰值點圖；左下圖為動作電位代表圖；右下圖為 APD30/APD50/APD80 比較線圖，顯示 30μM 地爾硫卓可使基因突變豬 APD 恢復至野生型基線水平。
圖5. 地爾硫卓干預實驗結果
膜片鉗實驗結果顯示，基因突變豬心室肌細胞的 IKr 峰值電流密度與尾電流密度均顯著降低，從電生理層面確認了通道功能缺陷，圖 6 左圖為野生型與基因突變豬原代心肌細胞 IKr 電流圖（黑線為基線，綠線為 E-4031 處理后）；中間圖為 E-4031 敏感性 IKr 電流（通過兩次電流相減獲得）；右圖為 E-4031 敏感性電流密度統(tǒng)計分析，直觀呈現基因突變豬 IKr 電流密度顯著降低的特征。
圖6. 膜片鉗實驗結果
單核轉錄組測序進一步揭示，突變豬心肌組織中鉀、鈣離子通道失衡，并伴有代謝水平下降與炎癥通路激活，為深入理解LQT2的復雜病理機制提供了新視角（圖7）。
圖7. 單細胞核轉錄組測序結果
綜上，本研究成功構建全球首個能夠高度模擬人類LQT2的基因編輯小型豬模型。相較于現有的長 QT 綜合征小動物模型，該大動物模型的建立是一項重大突破，為 LQT2 的基因治療研究和臨床前藥物篩選提供了極高的應用價值。鑒于 hERG 通道既是心律失常藥物治療的核心靶點，又與獲得性長 QT 綜合征密切相關，此模型具備廣泛的科研與臨床應用前景。
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