離體心臟NADH熒光標(biāo)測技術(shù)探究缺血再灌注對心肌及電生理特性的影響
心肌能量代謝狀態(tài)是反映心臟生理與病理變化的核心指標(biāo)，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）作為心肌能量代謝的關(guān)鍵物質(zhì)，其含量變化可直接表征心肌細(xì)胞的能量代謝水平。NADH在紫外光下具有自發(fā)熒光特性，為無創(chuàng)、實(shí)時(shí)監(jiān)測心肌能量代謝提供了天然標(biāo)記物，也成為離體心臟功能研究的重要觀測靶點(diǎn)。
基于此，本研究將可穩(wěn)定維持離體心臟生理活性的Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，與能夠精準(zhǔn)捕捉熒光信號的高分辨熒光標(biāo)測技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建了離體心臟NADH熒光標(biāo)測技術(shù)。該技術(shù)無需對NADH進(jìn)行外源性染料負(fù)載，可同步檢測心肌電生理指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)條件可控性強(qiáng)，能夠?qū)崟r(shí)、精準(zhǔn)地捕捉NADH熒光信號的動態(tài)變化，有效排除體內(nèi)復(fù)雜生理因素的干擾，為離體心臟的多模態(tài)功能檢測提供了穩(wěn)定可靠的技術(shù)平臺。
NADH 與動作電位的同步光學(xué)標(biāo)測，突破了傳統(tǒng)心臟電生理研究只能單一檢測電活動、無法同步解析能量代謝與電興奮交互調(diào)控的技術(shù)瓶頸，實(shí)現(xiàn)代謝‑興奮耦聯(lián)同視野、高時(shí)空分辨率動態(tài)捕捉，可闡明心肌生理病理狀態(tài)下代謝變化與電生理重構(gòu)的因果時(shí)序，精準(zhǔn)識別藥物心臟靶向效應(yīng)與脫靶風(fēng)險(xiǎn)，彌補(bǔ)傳統(tǒng)心臟安全性篩查不足，為心肌保護(hù)、心律失常機(jī)制研究與藥物研發(fā)提供創(chuàng)新視角與標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)工具。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/strong>
利用Langendorff灌流維持大鼠離體心臟的正常生理活動；利用高分辨熒光標(biāo)測技術(shù)同步檢測心肌缺血再灌注過程中NADH熒光幅值及心肌電生理相關(guān)指標(biāo)的動態(tài)變化，探究缺血再灌注對心肌能量代謝及電生理特性的影響。
實(shí)驗(yàn)動物：
SD大鼠
實(shí)驗(yàn)方法：
實(shí)驗(yàn)原理：
1. Langendorff離體心臟灌流技術(shù)原理：離體動物心臟在恒溫恒壓條件下，將心臟套管插入主動脈，逆行灌流含氧的灌注液，由冠狀動脈灌流心肌，灌流液經(jīng)冠狀靜脈竇從右心房、右心室、肺動脈端流出，以維持離體心臟在外界正常的生理活動。
2. 高分辨熒光標(biāo)測技術(shù)原理：在可興奮樣本上負(fù)載熒光染料，通過高速相機(jī)記錄熒光變化來反應(yīng)樣本中各種離子濃度的變化，也可同步記錄動作電位與鈣信號等指標(biāo)的改變。
Protocol（大鼠心臟NADH與動作電位同步標(biāo)測）
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
（一）主要試劑
KH灌流液、Blebbistatin、RH237、肝素鈉、異氟烷
（二）主要器材
手術(shù)剪、眼科剪、眼科彎鑷、止血鉗、手術(shù)縫線、注射器、主動脈插管、主動脈夾、培養(yǎng)皿
（三）主要溶液配方
1. KH solution（灌流液）
注：KCl、KH2PO4、MgCl2可配制為10×母液；溶液配好后需經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾；使用前，提前30min充氧（95% O2， 5% CO2）飽和。
2. 興奮-收縮解耦聯(lián)劑Blebbistatin母液，DMSO溶解1mg/mL，分裝為100µL/tube， -20℃儲存?zhèn)溆�。（摩爾質(zhì)量292g/mol）
3. 電壓敏感染料RH237，DMSO溶解為1mg/mL，分裝為100µL/tube。
注：NADH在紫外光下（365nm）自發(fā)熒光，無需進(jìn)行熒光染料負(fù)載；為避免反復(fù)凍融，將染料提前配制并進(jìn)行分裝儲存于-20 ℃。
4. 肝素鈉(1000U/mL)：用生理鹽水稀釋為所需濃度。
二、大鼠心臟獲取與處理
1. 對SD大鼠進(jìn)行稱重后，腹腔注射肝素鈉（3125U/kg），待15~20min后采用異氟烷麻醉，隨后脫頸處死。
2. 將處死的大鼠固定于實(shí)驗(yàn)臺，對腹部區(qū)域噴灑酒精消毒；剪開胸部皮膚暴露劍突，用鑷子夾起劍突并沿左、右肋中部剪開胸腔，充分暴露心臟。夾起肺葉提起心臟，沿肺后部快速剪取心臟，立即置于預(yù)充氧（95％O2，5％CO2）的KH灌流液中。
3. 剝離心臟表面多余組織，清晰暴露主動脈；在鑷子輔助下將主動脈快速套入灌流針，用主動脈夾固定后，以4-0手術(shù)縫線結(jié)扎主動脈與灌流針連接處（注：排除氣泡）；采用KH灌流液對心臟進(jìn)行逆行灌流，調(diào)節(jié)灌流速率至10mL/min，維持灌注壓在60~70mmHg，持續(xù)灌流15~20min，排出心臟內(nèi)殘余血液，使心臟恢復(fù)并維持正常節(jié)律。
4. 待心臟灌流狀態(tài)穩(wěn)定、無殘血流出后，將灌流體系切換為2號罐中預(yù)充氧的100mL KH灌流液，進(jìn)行循環(huán)灌流。
三、心臟停跳及熒光染色（全過程均在避光環(huán)境下進(jìn)行）
1. 心臟停跳：從灌流體系給藥口注入300μL Blebbistatin至100mL循環(huán)KH灌流液中，通過高濃度藥物作用減少心肌運(yùn)動偽跡，觀察至心肌收縮完全停止，全程約1~2min。
2. 熒光染料負(fù)載：向100mL 循環(huán)灌流體系中加入100μL 電壓敏感染料RH237，持續(xù)循環(huán)灌流15min，使染料充分負(fù)載于心肌組織。
3. 實(shí)驗(yàn)設(shè)備調(diào)試：按順序開啟高速相機(jī)、LED激發(fā)光源（520nm光源用于激發(fā)電壓敏感染料RH237，365nm光源用于激發(fā) NADH自發(fā)熒光）、電刺激器、主機(jī)及電腦終端，隨后啟動OS、OR熒光信號分析與記錄軟件，完成設(shè)備預(yù)熱與參數(shù)初始化。
高分辨熒光標(biāo)測技術(shù)原理示意圖
四、數(shù)據(jù)采集與記錄
1. 將完成染料負(fù)載的離體心臟轉(zhuǎn)移至恒溫灌流浴槽中，保持灌流條件穩(wěn)定。
2. 心電信號采集：將ECG電極分別置于心臟兩側(cè)，紅極（+）貼附左室壁，白極（-）貼附右心房，連接電極并調(diào)試設(shè)備，確保ECG信號采集穩(wěn)定。
3. 成像系統(tǒng)聚焦：將激發(fā)光精準(zhǔn)聚焦于心臟成像區(qū)域，調(diào)整雙攝像機(jī)與心臟的相對距離，調(diào)試至設(shè)備最大分辨率，確定并框選目標(biāo)成像區(qū)域，保證熒光信號采集清晰。
4. NADH熒光信號采集：以NADH熒光幅值變化作為核心檢測信號，對大鼠離體心臟實(shí)施左前降支結(jié)扎操作，動態(tài)采集并記錄結(jié)扎前、結(jié)扎過程中及復(fù)灌后不同時(shí)間點(diǎn)的NADH熒光幅值變化。
5. 多指標(biāo)同步檢測與對比：分別采集大鼠離體心臟左前降支結(jié)扎前、結(jié)扎不同時(shí)間點(diǎn)及復(fù)灌后，缺血區(qū)域的NADH熒光信號、傳導(dǎo)時(shí)間、動作電位時(shí)程等多項(xiàng)指標(biāo)，完成各時(shí)間點(diǎn)指標(biāo)的同步記錄與對比分析。
A. 心臟結(jié)扎前、結(jié)扎5min、復(fù)灌5min時(shí)NADH熒光、傳導(dǎo)時(shí)間、動作電位時(shí)程代表圖
B. 心臟結(jié)扎前、結(jié)扎5min、復(fù)灌5min時(shí)ECG Ⅱ 導(dǎo)聯(lián)代表圖
C. 心臟結(jié)扎前、結(jié)扎5min、復(fù)灌5min時(shí)缺血區(qū)域動作電位波形代表圖
D. 心臟缺血再復(fù)灌期間缺血區(qū)域NADH熒光動態(tài)變化統(tǒng)計(jì)圖
E. 心臟缺血再復(fù)灌期間缺血區(qū)域心率變化統(tǒng)計(jì)圖
F. 心臟缺血再復(fù)灌期間缺血區(qū)域動作電位激活時(shí)間動態(tài)變化統(tǒng)計(jì)圖
G. 心臟缺血再復(fù)灌期間缺血區(qū)域動作電位傳導(dǎo)速度動態(tài)變化統(tǒng)計(jì)圖
H. 心臟缺血再復(fù)灌期間缺血區(qū)域動作電位除極時(shí)間動態(tài)變化統(tǒng)計(jì)圖
I. 心臟缺血再復(fù)灌期間缺血區(qū)域動作電位時(shí)程動態(tài)變化統(tǒng)計(jì)圖
J. 心臟缺血再復(fù)灌期間缺血區(qū)域動作電位時(shí)程離散度變化統(tǒng)計(jì)圖
參考文獻(xiàn)：
[1]A. S G ,Zexu L ,R. I E .Simultaneous triple-parametric optical mapping of transmembrane potential, intracellular calcium and NADH for cardiac physiology assessment[J].CommunicationsBiology,2022,5(1):319-319.DOI:10.1038/S42003-022-03279-Y.
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