Pipetty電動(dòng)移液器在豬水皰病RT-PCR實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用
方案摘要： 本方案旨在明確Pipetty電動(dòng)移液器在豬水皰�。⊿VD）RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中的具體應(yīng)用，規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作流程，包括核酸提取、RT-PCR反應(yīng)體系配制、擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)等關(guān)鍵步驟。相較于傳統(tǒng)手動(dòng)移液器，Pipetty電動(dòng)移液器具備突出的連續(xù)分液優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)單次吸液、多次精準(zhǔn)分液，有效避免手動(dòng)反復(fù)吸液導(dǎo)致的體積誤差，同時(shí)降低長(zhǎng)時(shí)間操作帶來(lái)的手部疲勞，大幅提升移液效率；其精準(zhǔn)的體積控制的能力，能有效規(guī)避手動(dòng)移液器因人為按壓力度不均、操作手法差異造成的移液偏差，進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)性和檢測(cè)準(zhǔn)確性，為豬水皰病的快速、精準(zhǔn)診斷提供標(biāo)準(zhǔn)化操作依據(jù)。
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
豬水皰�。⊿VD）是由豬水皰病病毒（SVDV）引起的一種急性、接觸性傳染病，其核酸為單股正鏈RNA。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù)，首先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶將SVDV的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，利用特異性引物擴(kuò)增SVDV的特異性基因片段（目標(biāo)片段大小154bp）。
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② PCR儀；
③ 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；
④ 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀；
⑤ 水平電泳槽；
⑥ 凝膠成像儀(或紫外透射儀)；
⑦ 核酸提取儀；
⑧ 無(wú)核酸酶的離心管與吸頭；
⑨ PCR擴(kuò)增管；
⑩ 1.5mL離心管。
2、試劑和材料
① 引物:上游引物為 5-TTCAGAATGATTGCATATGGGG-3',
下游引物為5'-TCACGTTT-GTCCAGGTTACY-3'；
② 核酸提取試劑；
③ 酚-氯仿法試劑；
④ 無(wú)核酸酶水；
⑤ RT-PCR反應(yīng)試劑:一步法RT-PCR反應(yīng)緩沖液、RT-PCR 酶混合液(含反轉(zhuǎn)錄酶、Tag酶和RNase抑制劑等)；
⑥ 電泳緩沖液；
⑦ 瓊脂糖；
⑧ 電泳加樣緩沖液；
⑨ DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、選用酚-氯仿法、RNA提取試劑盒、自動(dòng)化核酸提取儀等方式進(jìn)行核酸提取。采用酚-氯仿法提取核酸按下列步驟:
a)用Pipetty電動(dòng)移液器取待檢樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各300μL，分別置于1.5mL無(wú)核酸酶離心管中，每管加入300μL變性液異硫氰酸胍或Trizol試劑，反復(fù)輕輕混勻，冰浴5min；
b)每管加入60μL 2mol/L乙酸鈉（pH4.0），輕輕混勻；
C）每管加入800μL苯酚-三氯甲烷-異戊醇混合液，輕輕顛倒混勻，冰浴5min；
D）8000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一潔凈離心管;
e)加800μL異丙醇，混勻，室溫放置15min;
f) 4℃，12000 r/min，離心10 min,倒掉上清液，盡量倒干液體，留下RNA沉淀;
g)加1000μL75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇顛倒洗滌沉淀，4℃，10 000r/min,離心5min。倒干液體,室溫干燥5 min~10 min;
h)使用Pipetty連續(xù)分液模式，每管加10μL無(wú)核酸酶水，用于溶解RNA�？俁NA提取液可立即用于RT-PCR擴(kuò)增，也可置于-70℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br />
2、為每個(gè)樣品準(zhǔn)備RT-PCR混合物，推薦為待檢的批量樣品整批準(zhǔn)備擴(kuò)增預(yù)混合體系為宜，并按照樣本數(shù)n+2+1準(zhǔn)備反應(yīng)體系。
3、RT-PCR檢測(cè)擴(kuò)增預(yù)混合體系為:
---------12.5μL 2×一步法RT-PCR反應(yīng)緩沖液;
---------1μL RT-PCR 酶混合液;
---------0.5μL上游引物10μmol/L;
---------0.5μL下游引物10μmol/L;
---------6.5μL無(wú)核酸酶水。
在已分裝有RT-PCR預(yù)混合體系的PCR擴(kuò)增管中，分別加入4μL已提取的總RNA，蓋緊管蓋，振蕩混勻后，瞬時(shí)離心。
4、將PCR擴(kuò)增管放入PCR儀中，按照設(shè)定程序進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增:50 ℃ 30 min；95 ℃5 min；然后94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后,擴(kuò)增產(chǎn)物置于4℃保存。
5、擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè):制備2%瓊脂糖凝膠，對(duì)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，同時(shí)加DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電壓80 V~100 V或電流40mA~50mA，電泳20min~30min。電泳結(jié)束后,將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀(或紫外透射儀)觀察。
6、試驗(yàn)成立條件：陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)154bp大小的特異性擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶。
四、結(jié)果判定
符合實(shí)驗(yàn)成立條件，待檢樣品擴(kuò)增出特異性條帶，且與陽(yáng)性對(duì)照條帶分子質(zhì)量大小相符,則該待檢樣品判定為SVDV核酸陽(yáng)性。待檢樣品無(wú)擴(kuò)增條帶，判為SVDV核酸陰性。在需要時(shí)，可取RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與SVDV特異性片段序列進(jìn)行比對(duì)。
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
豬水皰�。⊿VD）是由豬水皰病病毒（SVDV）引起的一種急性、接觸性傳染病，其核酸為單股正鏈RNA。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù)，首先通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶將SVDV的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，利用特異性引物擴(kuò)增SVDV的特異性基因片段（目標(biāo)片段大小154bp）。
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② PCR儀；
③ 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；
④ 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀；
⑤ 水平電泳槽；
⑥ 凝膠成像儀(或紫外透射儀)；
⑦ 核酸提取儀；
⑧ 無(wú)核酸酶的離心管與吸頭；
⑨ PCR擴(kuò)增管；
⑩ 1.5mL離心管。
2、試劑和材料
① 引物:上游引物為 5-TTCAGAATGATTGCATATGGGG-3',
下游引物為5'-TCACGTTT-GTCCAGGTTACY-3'；
② 核酸提取試劑；
③ 酚-氯仿法試劑；
④ 無(wú)核酸酶水；
⑤ RT-PCR反應(yīng)試劑:一步法RT-PCR反應(yīng)緩沖液、RT-PCR 酶混合液(含反轉(zhuǎn)錄酶、Tag酶和RNase抑制劑等)；
⑥ 電泳緩沖液；
⑦ 瓊脂糖；
⑧ 電泳加樣緩沖液；
⑨ DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、選用酚-氯仿法、RNA提取試劑盒、自動(dòng)化核酸提取儀等方式進(jìn)行核酸提取。采用酚-氯仿法提取核酸按下列步驟:
a)用Pipetty電動(dòng)移液器取待檢樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各300μL，分別置于1.5mL無(wú)核酸酶離心管中，每管加入300μL變性液異硫氰酸胍或Trizol試劑，反復(fù)輕輕混勻，冰浴5min；
b)每管加入60μL 2mol/L乙酸鈉（pH4.0），輕輕混勻；
C）每管加入800μL苯酚-三氯甲烷-異戊醇混合液，輕輕顛倒混勻，冰浴5min；
D）8000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一潔凈離心管;
e)加800μL異丙醇，混勻，室溫放置15min;
f) 4℃，12000 r/min，離心10 min,倒掉上清液，盡量倒干液體，留下RNA沉淀;
g)加1000μL75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇顛倒洗滌沉淀，4℃，10 000r/min,離心5min。倒干液體,室溫干燥5 min~10 min;
h)使用Pipetty連續(xù)分液模式，每管加10μL無(wú)核酸酶水，用于溶解RNA�？俁NA提取液可立即用于RT-PCR擴(kuò)增，也可置于-70℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br />
2、為每個(gè)樣品準(zhǔn)備RT-PCR混合物，推薦為待檢的批量樣品整批準(zhǔn)備擴(kuò)增預(yù)混合體系為宜，并按照樣本數(shù)n+2+1準(zhǔn)備反應(yīng)體系。
3、RT-PCR檢測(cè)擴(kuò)增預(yù)混合體系為:
---------12.5μL 2×一步法RT-PCR反應(yīng)緩沖液;
---------1μL RT-PCR 酶混合液;
---------0.5μL上游引物10μmol/L;
---------0.5μL下游引物10μmol/L;
---------6.5μL無(wú)核酸酶水。
在已分裝有RT-PCR預(yù)混合體系的PCR擴(kuò)增管中，分別加入4μL已提取的總RNA，蓋緊管蓋，振蕩混勻后，瞬時(shí)離心。
4、將PCR擴(kuò)增管放入PCR儀中，按照設(shè)定程序進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增:50 ℃ 30 min；95 ℃5 min；然后94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后,擴(kuò)增產(chǎn)物置于4℃保存。
5、擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè):制備2%瓊脂糖凝膠，對(duì)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，同時(shí)加DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電壓80 V~100 V或電流40mA~50mA，電泳20min~30min。電泳結(jié)束后,將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀(或紫外透射儀)觀察。
6、試驗(yàn)成立條件：陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)154bp大小的特異性擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶。
四、結(jié)果判定
符合實(shí)驗(yàn)成立條件，待檢樣品擴(kuò)增出特異性條帶，且與陽(yáng)性對(duì)照條帶分子質(zhì)量大小相符,則該待檢樣品判定為SVDV核酸陽(yáng)性。待檢樣品無(wú)擴(kuò)增條帶，判為SVDV核酸陰性。在需要時(shí)，可取RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與SVDV特異性片段序列進(jìn)行比對(duì)。
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