方案摘要：本方案整合了Pipetty電動移液器精準(zhǔn)控量、連續(xù)移液、操作穩(wěn)定以及防交叉污染等核心優(yōu)勢，對樣品處理、RNA提取、反應(yīng)體系配制等關(guān)鍵操作環(huán)節(jié)予以規(guī)范，規(guī)避手動移液過程中易出現(xiàn)的誤差、效率低下以及污染風(fēng)險等問題，充分發(fā)揮其移液精準(zhǔn)度高、重復(fù)性強、操作便捷的特性，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、一致性與可靠性，為馬流感的快速、精準(zhǔn)檢測提供標(biāo)準(zhǔn)化操作依據(jù)。適用于動物疫病防控機構(gòu)、獸醫(yī)實驗室等開展馬流感核酸檢測工作，有助于提升檢測工作的效率與質(zhì)量。
 
 
方案詳情：
一、實驗原理
馬流感（Equine Influenza, EI）是由馬流感病毒（Equine Influenza Virus, EIV）引起的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病，主要亞型為H3N8，實時熒光RT-PCR技術(shù)是基于逆轉(zhuǎn)錄（RT）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）結(jié)合熒光信號檢測的核酸檢測方法，可實現(xiàn)對EIV核酸的快速、靈敏、特異檢測。其核心原理為：首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，利用特異性引物和熒光探針，在PCR儀中進行指數(shù)級擴增；擴增過程中，熒光探針與目的片段特異性結(jié)合，隨著擴增循環(huán)的進行，熒光信號不斷累積，通過實時檢測熒光強度，可定量或定性判斷樣品中是否含有EIV核酸。
 
 
二、‌實驗準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 實時熒光PCR儀；
③ 低溫臺式高速離心機；
④ 瞬時離心機。
 
2、試劑和材料
① 病毒RNA提取試劑盒。
② 一步法熒光RT-PCR試劑盒。
③ 透明薄壁PCR管(0.2mL)或PCR八聯(lián)管或96孔PCR反應(yīng)板；
④ 引物和探針；
⑤ 陽性對照:EIV雞胚/細胞培養(yǎng)物、EIV核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品/質(zhì)控品、感染EIV的陽性組織樣品、實時熒光RT-PCR陽性對照質(zhì)粒均可作為陽性對照；
⑥ 陰性對照(DEPC處理水)。
 
 
 
三、實驗步驟
1、將采集的拭子樣品充分捻動、擠干后，使用Pipetty電動移液器MSIC01-03-1000單次模式，精準(zhǔn)移取200μL樣品液，轉(zhuǎn)入無菌離心管中，備用。
 

1. 使用病毒RNA提取試劑盒，按試劑盒說明書步驟提取病毒RNA：借助Pipetty電動移液器，精準(zhǔn)移取試劑盒中的裂解液、洗滌液等試劑，加入樣品液中，充分混勻后經(jīng)低溫臺式高速離心機離心處理；最后用移液器移取洗脫液，收集提取的病毒RNA。提取的病毒RNA應(yīng)立即進行RT-PCR反應(yīng)，若暫不反應(yīng)，需置于-70°C冰箱保存。

 
3、實驗前將所有試劑置于冰上融化，融化后輕輕顛倒混勻，瞬時離心。計算所需PCR反應(yīng)管數(shù)量，取n+2個PCR反應(yīng)管（n為待檢樣品、陽性對照和陰性對照數(shù)總和）。按照下表配制反應(yīng)體系，所有試劑移取均使用對應(yīng)量程的Pipetty電動移液器，其連續(xù)分液模式，不僅可以確保移液精準(zhǔn)，避免交叉污染，還能提高實驗效率，減少手部負擔(dān)。
 

1. 將加樣后的反應(yīng)管按順序放入實時熒光PCR儀中，并按下列程序進行反應(yīng):42°C反轉(zhuǎn)錄30min，94 °C預(yù)變性3 min,進行1個循環(huán);92°C變性10 s,60 °C退火30 s.進行40個循環(huán)。

注:反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，根據(jù)所使用實時熒光RT-PCR試劑盒不同，適當(dāng)調(diào)整各試劑用量及反應(yīng)溫度和時間。
 
四、結(jié)果判定
1、讀取Ct值，陰性對照無Ct值，且無擴增曲線;陽性對照的Ct值≤30.且有特異性擴增曲線。
2、陽性
待檢測樣品Ct值≤35，且出現(xiàn)特定的擴增曲線，判定為H3N8亞型EIV核酸陽性。
3、陰性
待檢測樣品無Ct值且無擴增曲線，判定為H3N8亞型EIV核酸陰性。
4、疑似
待檢測樣品3535,即使出現(xiàn)特異性擴增曲線，仍判定為H3N8亞型EIV核酸陰性。