1. 設(shè)計制備：將目標(biāo)膜蛋白DNA序列輸入配套軟件，設(shè)計并制備對應(yīng)的表達(dá)載體；
2. 自動篩選：系統(tǒng)通過數(shù)字微流控芯片，同步測試多組表達(dá)環(huán)境，評估膜蛋白可溶性產(chǎn)量,可同時自動篩選多達(dá)88種膜蛋白表達(dá)條件，24小時內(nèi)完成11種DNA構(gòu)建體和8組表達(dá)條件的篩選；
3. 放大生產(chǎn)：根據(jù)篩選數(shù)據(jù)確定適宜條件，直接放大生產(chǎn)，獲得可用于下游分析的膜蛋白。

圖1：eProtein Discovery系統(tǒng)膜蛋白生產(chǎn)工作流程。

該系統(tǒng)與傳統(tǒng)技術(shù)不同，基于無細(xì)胞蛋白表達(dá)合成技術(shù)無需去垢劑膜提取，可直接優(yōu)化納米盤為膜蛋白提供類天然脂質(zhì)環(huán)境，維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定與生物活性，這也是實現(xiàn)難表達(dá)蛋白快速獲取的關(guān)鍵所在。

實驗驗證：制備活性與結(jié)構(gòu)雙完整的膜蛋白
以原核生物ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MsbA（典型難表達(dá)膜蛋白，因特殊結(jié)構(gòu)易低產(chǎn)、錯誤折疊）為例，系統(tǒng)可同時測試不同納米盤組成、去垢劑及氧化還原條件，準(zhǔn)確快速篩選適配表達(dá)方案。

相關(guān)實驗數(shù)據(jù)證實，該系統(tǒng)制備膜蛋白的效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法：

對比傳統(tǒng)去垢劑Brij-35，采用MSP1D1 dH5-DMPG特定納米盤組合，能提升MsbA的表達(dá)產(chǎn)量；優(yōu)化條件下放大生產(chǎn)后，可獲得濃度約120 μg/mL的純化MsbA，濃縮后濃度達(dá)1.8 mg/mL且無明顯聚集。
 

圖2：MsbA的放大培養(yǎng)與濃縮。(A) 優(yōu)化納米盤條件下純化的MsbA產(chǎn)量，與卡盒預(yù)測產(chǎn)量（藍(lán)色）的對比。(B)未濃縮MsbA的SDS-PAGE分析。

ATP酶活性測定顯示，制備的MsbA具備預(yù)期酶活性，底物脂質(zhì)A可刺激活性、抑制劑釩酸鹽能抑制活性，證實蛋白功能完整；冷凍電鏡分析進(jìn)一步表明，納米盤環(huán)境中制備的MsbA折疊構(gòu)象正確、呈二聚化狀態(tài)，與已發(fā)表的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)特征一致。

該系統(tǒng)無需依賴去垢劑提取，可在兩天內(nèi)制備出活性與結(jié)構(gòu)均完整的膜蛋白，有效解決了傳統(tǒng)流程中去垢劑導(dǎo)致的蛋白不穩(wěn)定性問題，為膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究提供了全新途徑。

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