基因和siRNA選擇

RNAi實驗的通量可從沉默單個感興趣的基因，到少量相關(guān)基因或同一個通路上的基因，到全基因組高通量篩選，取決于需要解決的生物學(xué)問題。siRNA的設(shè)計至關(guān)重要。

轉(zhuǎn)染優(yōu)化

用于RNAi實驗的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)有效轉(zhuǎn)染siRNA。轉(zhuǎn)染必須經(jīng)過優(yōu)化確保siRNA的濃度是最低的有效濃度以避免非特異性效應(yīng)。轉(zhuǎn)染的方法應(yīng)當(dāng)高效、低毒性、便于實驗設(shè)置

表型分析

表型分析通常涉及細(xì)胞學(xué)分析來檢測一系列的細(xì)胞參數(shù)，包括存活率、可測物產(chǎn)量、蛋白定位改變、離子濃度、細(xì)胞的運動、形態(tài)等。

沉默驗證

建議使用至少2條siRNA針對同一mRNA不同的序列。針對同一基因的2條獨立siRNA引起同樣的脫靶效應(yīng)的可能性非常低。因此，使用不同的siRNA確認(rèn)表型是一種應(yīng)用起來簡單且有說服力的方式來證明所觀察到的表型是特異性基因沉默的結(jié)果。使用多條siRNA來驗證結(jié)果已經(jīng)是發(fā)表RNAi結(jié)果時許多雜志所必要的條件�；�因沉默驗證可通過real-time RT-PCR檢測mRNA水平或western blotting檢測蛋白水平。

RT-PCR相關(guān)試劑盒http:///tools/search.asp?kw2=RT-PCR&tn=5