分子生物學相關實驗步驟及注意事項（二）--反轉錄篇
——反轉錄篇——
反轉錄PCR（Reverse Transcription, RT-PCR）又稱為逆轉錄PCR，是指擴增mRNA的一種實驗技術。先將mRNA反轉錄成cDNA，然后再以cDNA為模板，用PCR方法加以擴增。
（一）逆轉錄酶的種類
AMV：有較強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適42℃。在高反應溫度時可消除mRNA的二級結構對逆轉錄的阻礙，然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA產(chǎn)生也限制其長度。
MMLV：有強的聚合酶活性，而RNA酶H活性較弱。較弱的RNA酶H活性對獲得2-3kb的mRNA的全長cDNA有很大好處。最適37℃。
Super RNaseH- Reverse Transcriptase：MMLV反轉錄酶的RNase H-突變體，它能將更大部分的RNA轉換成cDNA，這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的模板合成較長的cDNA，最適42℃。（商品名為SuperScript和SuperScriptⅡ）
GoScript Reverse Transcriptase：專為 qPCR 而設計，利用 M-MLV 和先進的緩沖液技術獲得均衡穩(wěn)定和可靠的 cDNA 合成結果，適合各種大小范圍的低豐度和高豐度的轉錄子，即使存在抑制劑也不受影響。
根據(jù)很多實驗人員的經(jīng)驗反映，Promega的反轉錄酶效果杠杠滴，本人用過TaKaRa的，也是不錯噠！大家可以根據(jù)自身情況進行選擇。
（二）引物的選擇
反轉錄引物有多種選擇，Oligo(dT)、隨機引物、基因特異性引物（GSP）等。
用來進行反轉錄的引物及其常用的推薦濃度如下表所示：
|
引物
|
常用終濃度
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調整范圍
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|---|---|---|
| Oligo(dT)15 |
0.025µg/µl
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0.01–0.125µg/µl
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| Random Primer |
0.025µg/µl
|
0.01–0.1µg/µl
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| Oligo(dT)15＋Random Primer |
0.025µg/µl each primer
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Each 0.01–0.1µg/µl
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| Gene-specific primer |
1µM
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0.5–0.1µM
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（表格引用Promega公司的 GoScript 反轉錄系統(tǒng)操作方法說明書）
（三）優(yōu)化及注意事項
1. 逆轉錄PCR時，提取RNA是關鍵，需分離高質量RNA（純度和完整性）。
2. 整個操作過程需使用祛RNA酶耗槍頭及EP管。
3. 反轉錄過程中要謹防RNA酶的污染，加入RNA酶抑制劑。
4. 為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。
5. 使用無RNaseH活性的逆轉錄酶
6. 提高逆轉錄酶保溫溫度
7. 減少基因組DNA污染
8. 對于反轉錄酶活性來說，二價陽離子是必需的。 對于大多數(shù)反轉錄反應，建議加入氯化鎂至鎂離子終濃度為2.5 mM 以得到最佳結果，可在1.5到5mM范圍內調整優(yōu)化。對于長片段 RNA 的反轉錄，可以降低鎂離子濃度以提高延伸的完整性；短片段RNA的反轉錄，可以提高鎂離子濃度以提高反轉錄的效率。
下一期的熒光定量PCR篇，敬請期待！
