布魯頓酪氨酸激酶（Bruton's Tyrosine Kinase，BTK）屬于Tec家族激酶，主要存在于B細胞和髓樣細胞中，是B細胞抗原受體（BCR）信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與B細胞的發(fā)育、活化、增殖及分化等過程，其在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

一、BTK相關(guān)通路
BTK在BCR信號通路中處于核心地位。當抗原與BCR結(jié)合后，引發(fā)BCR的寡聚化，激活Lyn、Syk等激酶，進而激活BTK。激活后的BTK與BLNK、Lyn、SYK等蛋白形成信號復合體，并磷酸化磷脂酶C（PLC）γ2，導致細胞內(nèi)鈣離子釋放，通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶和NF-κB信號通路的傳導，誘導基因表達的改變，從而促進B細胞的存活、增殖和分化。此外，BTK還參與 FcR、細胞因子、趨化因子等信號通路，在免疫調(diào)節(jié)中扮演著關(guān)鍵角色。

圖、BTK在BCR信號通路中的示意圖1

二、靶向BTK已上市藥物
BTK抑制劑是一類針對布魯頓酪氨酸激酶（BTK）的藥物。自從第一個BTK抑制劑伊布替尼于2013年上市以來，BTK抑制劑在血液瘤中得到了廣泛應用，目前上市的BTK抑制劑主要分為以下幾類：

（一）不可逆共價抑制劑
1、伊布替尼（Ibrutinib）：2013年首次獲批，是第一代BTK抑制劑的代表藥物，通過與BTK活性位點中的半胱氨酸殘基（Cys481）形成共價鍵，不可逆地抑制BTK的活性，從而抑制腫瘤細胞的增殖和存活，在多種B細胞惡性腫瘤的治療中取得了顯著效果，如慢性淋巴細胞白血�。–LL）、小淋巴細胞淋巴瘤（SLL）、套細胞淋巴瘤（MCL）、華氏巨球蛋白血癥（WM）等，還獲批用于治療慢性移植物抗宿主病（cGVHD）。

2、阿卡替尼（Acalabrutinib）：2017年獲批，是一種第二代不可逆共價BTK抑制劑，對BTK的選擇性較高，主要用于治療CLL/SLL和MCL等疾病。

3、澤布替尼（Zanubrutinib）：2019年獲批，也是第二代不可逆共價BTK抑制劑，具有較高的BTK選擇性，在CLL/SLL、MCL、MZL、WM等多種B細胞惡性腫瘤中顯示出良好的療效。

4、替拉布替尼（Tirabrutinib）：2020年3月在日本獲批用于治療復發(fā)/難治性原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤（PCNSL），2021年3月在日本獲批用于治療華氏巨球蛋白血癥（WM），2021年9月在日本獲批用于治療復發(fā)/難治性淋巴漿細胞淋巴瘤（LPL）

5、奧布替尼（Orelabrutinib）：2020年在中國獲批，用于治療復發(fā)/難治性套細胞淋巴瘤（MCL）、復發(fā)/難治性慢性淋巴細胞白血�。–LL）/小淋巴細胞淋巴瘤（SLL）。

（二）    可逆非共價抑制劑
匹托布魯替尼（Pirtobrutinib）：2023年獲批，是目前唯一上市的第三代BTK抑制劑，采用非共價結(jié)合機制，可與BTK的非活性構(gòu)象結(jié)合，有望克服因BTK C481S突變而產(chǎn)生的耐藥性問題，用于治療既往接受過至少一種BTK抑制劑治療的復發(fā)或難治性CLL/SLL、MCL成人患者。

（三）BTK降解劑
BGB-16673：是百濟神州研發(fā)的PROTAC藥物，通過招募E3泛素連接酶來誘導BTK蛋白降解，從源頭上解決耐藥蛋白累積的問題，早期臨床數(shù)據(jù)令人矚目，2025年5月已啟動頭對頭挑戰(zhàn)吡托布魯替尼的III期研究。

三、BTK靶點在自免疾病潛力
BTK抑制劑目前在自身免疫性疾病領(lǐng)域全球尚未成藥。奧布替尼在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)末梢周圍對脫髓鞘疾病的治療中能夠發(fā)揮潛在效果。憑借高靶向選擇性、安全性和血腦屏障（BBB）穿透能力，奧布替尼為治療自身免疫性疾病提供了極具前景的治療方案。

諾誠健華，奧布替尼在自免疾病治療中，依據(jù)臨床數(shù)據(jù)顯示呈現(xiàn)出積極效果。

①多發(fā)性硬化（MS），奧布替尼治療MS全球多中心II期臨床數(shù)據(jù)分析顯示，三個劑量組的 24 周數(shù)據(jù)都達到主要終點，每天一次80毫克劑量組顯示了最優(yōu)的有效性，并且在整個 24周內(nèi)病灶控制效果最佳，安全性也最好，這表明每天一次80毫克有潛力成為治療MS的最佳劑量。

②系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE），奧布替尼治療SLE的II期臨床試驗取得積極效果，療效呈劑量依賴性的改善趨勢。奧布替尼治療SLE預計2024年完成患者入組。我們期待奧布替尼成為潛在治療SLE的first-in-class BTK抑制劑。

注：以上信息來自諾誠健華官網(wǎng)

四、BTK靶點研究相關(guān)檢測
（一）THUNDER TR-FRET磷酸化BTK /總BTK檢測
THUNDER TR-FRET采用經(jīng)典的雙抗夾心檢測模型檢測Phospho-BTK和Total BTK水平，兩個標記了熒光Eu和FR的抗體分別識別BTK不同表位，抗體結(jié)合到BTK后，熒光基團相互靠近，320nm激發(fā)后進而產(chǎn)生FRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移），從而在665nm檢測熒光信號值。THUNDER檢測技術(shù)特異性好，靈敏度高，重復性好，通量高，操作簡單，抗體孵育僅需4h，手動15min即可完成實驗。

圖、THUNDER BTK磷酸化檢測原理及流程圖      

圖：磷酸化BTK和total BTK在Raji細胞系中激動劑和抑制劑驗證數(shù)據(jù)

（二）BTK激酶活性檢測
ADP激酶活性檢測，基于生物發(fā)光法的激酶/ATP酶活性檢測系統(tǒng)，通過檢測激酶反應中生成的ADP量來反映酶活性。

圖：UA-GLO檢測原理示意圖

1、UA-GLO激酶活性檢測試劑盒優(yōu)勢
① ATP濃度從1μM到1mM 都可以用于實驗，可區(qū)分競爭性和非競爭性的激酶抑制劑
② 極高的靈敏度和更大的動態(tài)量程：低至0.25pmol的ADP可以被檢測到
③ 信號穩(wěn)定：熒光信號0.5-12hr內(nèi)均可檢測
④ 便捷的實驗步驟
⑤ 適合于高通量檢測

2、UA-GLO激酶活性檢測試劑盒數(shù)據(jù)
檢測化合物H-89 和PKI的EC50。ATP 競爭性化合物H8-9 和ATP 非競爭性化合物PKI是激酶PKA的抑制劑。兩個化合物在三個ATP濃度:10/100/500μM 的條件下進行激酶反應之后用UA-Glo 激酶ADP檢測試劑檢測產(chǎn)生的ADP。化合物在不同ATP 濃度下的劑量-效果曲線和EC50結(jié)果見下圖。ATP競爭性化合物H8-9的EC50隨反應中ATP濃度增加而增大，而ATP非競爭性化合物PKI的EC50基本不受ATP濃度的影響。使用市場領(lǐng)先品牌PC對H8-9在同樣實驗條件，ATP 濃度10μM和100μM時測得EC50分別為65nM和567nM, 和UA-Glo激酶ADP檢測試劑測得EC值一致。

檢測化合物星形孢菌素對三種激酶的EC50。星形孢菌素（Staurosporine, STSP）為多種激酶的抑制劑。用UA-Glo 激酶ADP檢測試劑檢測了STSP在不同ATP濃度下對三種激酶(PKA, CDK2/CycE1, SRPK1)的EC50。STSP在不同ATP濃度下的劑量-效果曲線和EC50結(jié)果見下圖，所得EC50和文獻報道一致。

（三）    BTK激酶

BTK Protein，GST tag

（四）    BTK PROTAC研究E3連接酶

DDB1/CRBN Complex, His Tag Protein

圖：The CRBN/DDB1 activity was detected using HTRF technology.The reaction was performed by incubating the varying concentration of lenalidomide,CRBN/DDB1protein, substrate and beads at 25℃ for 60 min, then reading ratio 665/620 with BMG.

（五）PROTAC三元復合物檢測（PROTAC binding assay）
THUNDER TR-FRET技術(shù)檢測PROTAC三元復合物結(jié)合，選擇標記熒光供體Eu的 Anti-Tag1的抗體和標記熒光受體FR的Anti-Tag2的抗體，抗體分別識別并結(jié)合E3連接酶和靶蛋白，加入PROTAC后，一對檢測抗體相互靠近，激發(fā)Eu產(chǎn)生FRET，能量傳遞給FR，即可檢測到665nm熒光信號。信號強度與PROTAC結(jié)合能力成正比關(guān)系。抗體孵育僅需1小時，是檢測蛋白蛋白相互作用的利器。

圖：THUNDER 檢測PROTAC三元復合物結(jié)合示意圖

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