一、靶向PGK1抑制糖酵解-激酶雙功能調控巨噬細胞炎癥因子表達及其在結腸炎治療中的潛力
糖酵解代謝酶通過感知代謝狀態(tài)變化，在免疫代謝領域發(fā)揮關鍵調控作用。磷酸甘油酸激酶1（PGK1）作為糖酵解途徑中的關鍵催化酶，其功能調控受到廣泛關注。本研究首先構建了高通量篩選平臺，成功鑒定出一種新型PGK1抑制劑DC-PGKI。該抑制劑以ATP競爭性方式結合PGK1，解離常數（Kd）為99.08 nmol/L，表現出高親和力。研究證實，DC-PGKI在體外及體內均能穩(wěn)定PGK1蛋白水平，并有效抑制其糖酵解活性與激酶功能。進一步研究發(fā)現，DC-PGKI可顯著影響脂多糖（LPS）刺激下巨噬細胞的炎癥應答，具體表現為抑制白細胞介素-1β（IL-1β）和白細胞介素-6（IL-6）的產生。機制研究表明，抑制PGK1可導致核因子E2相關因子2（NRF2，由NFE2L2基因編碼）在細胞內積累，并促進其向細胞核轉位。進入細胞核的NRF2能夠結合于*Il-1b*與*Il-6*基因的鄰近調控區(qū)域，從而抑制LPS誘導的上述基因轉錄表達。在疾病模型中，應用DC-PGKI干預能有效緩解葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的小鼠結腸炎癥狀。上述結果不僅證實了PGK1在巨噬細胞炎癥反應中的關鍵調節(jié)作用，也揭示了靶向PGK1開發(fā)抑制劑為炎癥性腸病等炎癥性疾病提供潛在治療策略的科學依據。

二、基于反向偶聯反應的PGK1高通量篩選平臺建立與抑制劑鑒定
為篩選靶向PGK1的小分子抑制劑，本研究建立了一種基于酶偶聯反應的高通量檢測平臺。該平臺利用PGK1與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）共同催化的可逆反應特性，通過監(jiān)測NADH在340 nm處的吸光度變化，間接反映PGK1的催化活性。具體而言，在含有3-磷酸甘油酸（3-PG）、ATP、NADH及過量GAPDH的反應體系中，加入PGK1可啟動逆反應生成1,3-二磷酸甘油酸（1,3-BPG），后者立即被GAPDH還原并伴隨NADH消耗，從而實現對PGK1酶動力學的實時監(jiān)測（圖1A）。

首先，對從大腸桿菌表達系統(tǒng)純化的重組PGK1進行酶學表征，其動力學參數（1,3-BPG的Km = 189.4 ± 4.8 μmol/L，ATP的Km = 1.30 ± 0.11 mmol/L，Kcat = 956 ± 41.7 s⁻¹）與已報道的人源PGK1數據一致。經條件優(yōu)化，最終確定反應體系中PGK1與GAPDH的最佳濃度分別為0.40 nmol/L與0.10 μmol/L，以保證GAPDH始終處于過量狀態(tài)。該檢測體系在驗證中顯示出良好的穩(wěn)定性與重現性，其Z因子為0.54，符合高通量篩選要求（圖1B）。

利用該平臺對內部化合物庫進行初步篩選，在單劑量50 μmol/L條件下選取抑制率高于50%的化合物進行劑量-反應分析，并進一步通過GAPDH單獨催化實驗排除非特異性干擾分子。最終鑒定出包括dorsomorphin、purvalanol A、MK-571及LTP-10在內的多個PGK1抑制劑，其IC50值介于1.96至25.24 μmol/L之間（圖1C–D）。其中，purvalanol A的抑制活性（IC50 = 1.96 μmol/L）與文獻報道一致，證實了本篩選體系的可靠性。為進一步探究其作用機制，選取具有新穎化學結構的LTP-10進行深入分析。酶動力學研究表明，LTP-10對底物3-PG表現為非競爭性抑制，而對ATP則呈現競爭性抑制模式，其Ki值為2.59 ± 0.01 μmol/L（圖1E–F）。此外，熱穩(wěn)定性實驗表明，LTP-10可顯著提高PGK1的熱變性溫度，提示其可能通過結合并穩(wěn)定PGK1蛋白構象發(fā)揮抑制作用。以上結果驗證了該篩選平臺在發(fā)現與表征PGK1抑制劑方面的有效性與應用價值。

三、DC-PGKI通過靶向PGK1抑制巨噬細胞炎性因子IL-1β與IL-6的表達
代謝重編程在免疫細胞炎癥應答中發(fā)揮關鍵作用，尤其與有氧糖酵解過程密切相關。先前研究表明，糖酵解酶PKM2可通過磷酸化STAT3等信號分子，促進白細胞介素-1β（IL-1β）與白細胞介素-6（IL-6）的表達，其小分子抑制劑在多種炎癥模型中顯示出治療潛力。受此啟發(fā)，本研究探討了另一關鍵糖酵解酶PGK1是否在巨噬細胞炎癥調控中具有類似功能。

本研究利用PGK1抑制劑DC-PGKI作為化學探針，在脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7細胞及原代骨髓來源巨噬細胞（BMDM）中評估其對炎性因子表達的影響。結果顯示，DC-PGKI以濃度依賴性方式顯著抑制LPS誘導的*Il-1b*與*Il-6*的mRNA表達（圖4A–B），并降低其蛋白水平（圖4C），而對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達無顯著影響。與已知糖酵解抑制劑2-DG及PKM2特異性抑制劑TEPP-46/DASA-58相比，DC-PGKI對IL-1β與IL-6均具有抑制作用，提示其作用機制可能不僅限于干擾糖酵解代謝途徑。為進一步驗證DC-PGKI的作用依賴于PGK1，本研究通過RNA干擾技術敲低巨噬細胞中PGK1的表達。結果顯示，PGK1敲低可模擬DC-PGKI的效應，顯著抑制IL-1β與IL-6的產生（圖4E–G），且不影響TNF-α表達。此外，在PGK1敲低細胞中回補表達siRNA抗性的PGK1蛋白，可恢復IL-1β與IL-6的表達水平（圖4H），表明DC-PGKI對炎性因子的抑制作用是經由PGK1介導的。綜上，本研究證實PGK1在巨噬細胞炎癥應答中具有重要調控功能，其抑制劑DC-PGKI可通過靶向PGK1選擇性抑制IL-1β與IL-6的表達，為炎癥性疾病的靶向治療提供了新的實驗依據。

四、DC-PGKI通過KEAP1-NRF2通路抑制IL-1β與IL-6表達
既往研究提示，抑制PGK1可能影響KEAP1的翻譯后修飾，從而促進核因子E2相關因子2（NRF2）的積累及其下游抗氧化基因的轉錄。類似地，內源性代謝物衣康酸可通過修飾KEAP1激活NRF2并發(fā)揮抗炎作用。基于此，本研究進一步探討DC-PGKI是否通過調控NRF2通路介導其抗炎效應。

結果表明，DC-PGKI處理可呈時間與濃度依賴性地下調KEAP1蛋白水平，并相應增加NRF2蛋白表達及其經典下游靶基因血紅素加氧酶1（HMOX1）的mRNA與蛋白水平（圖5A–C）。在脂多糖（LPS）刺激與否的條件下，DC-PGKI均能顯著上調包括Txnrd1、Prdx1、Gclc、Sod1等在內的多個NRF2調控基因的表達（圖5E–H）。此外，在293T細胞中進行的NRF2依賴性熒光素酶報告基因實驗進一步證實DC-PGKI可激活NRF2轉錄活性（圖5D）。在KEAP1突變或缺失的細胞系中，DC-PGKI未引起NRF2積累，表明其作用具有KEAP1依賴性。為明確NRF2在DC-PGKI抑制炎性因子表達中的作用機制，本研究通過染色質免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）分析發(fā)現，經DC-PGKI處理后，NRF2在Il-1b、Il-6及經典靶基因Nqo1啟動子鄰近區(qū)域的結合顯著增強（圖6I–K），而對照基因血栓烷合酶（Txs）內含子區(qū)未見明顯變化。綜上所述，DC-PGKI可通過降低KEAP1蛋白穩(wěn)定性，促進NRF2核轉位及其與靶基因啟動子的結合，從而抑制IL-1β與IL-6的表達。該結果揭示了PGK1抑制劑調控炎癥反應的一條新機制，即通過激活KEAP1-NRF2抗氧化通路實現抗炎作用。

五、總結
本研究圍繞糖酵解關鍵酶PGK1在巨噬細胞炎癥反應中的調控作用展開系統(tǒng)性探索。首先，成功構建了基于反向酶偶聯反應的高通量篩選平臺，并鑒定出新型ATP競爭性抑制劑DC-PGKI。該抑制劑不僅有效抑制PGK1的糖酵解與激酶雙功能，更通過靶向PGK1選擇性抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥因子IL-1β和IL-6表達，而對TNF-α無顯著影響。進一步機制研究表明，DC-PGKI通過促進KEAP1降解，激活NRF2信號通路，增強NRF2核轉位及其與*Il-1b*、*Il-6*基因啟動子區(qū)域的結合，從而在轉錄水平抑制炎癥因子表達。最終，在DSS誘導的結腸炎模型中，DC-PGKI展現出明確的治療潛力。本研究成果不僅揭示了PGK1在免疫代謝調控中的新功能，也為其作為炎癥性疾病（如炎癥性腸�。┑闹委煱悬c提供了理論與實驗依據。

六、IL-1 β/L-1F2細胞因子檢測哪里有？
IL-1β（又名IL-1F2）是固有免疫與炎癥反應的核心介質，在感染、損傷及腫瘤微環(huán)境中起關鍵驅動作用。其信號通過調控炎性細胞浸潤、免疫細胞分化及細胞因子級聯，深度重塑腫瘤免疫應答格局。