蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)：蛋白質(zhì)糖基化修飾
糖蛋白質(zhì)組學(xué)（Glycoproteomics）作為蛋白質(zhì)組學(xué)的重要分支，聚焦于生物體內(nèi)糖基化修飾蛋白的系統(tǒng)鑒定、定量分析及功能解析，是后基因組時(shí)代生命科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域之一。糖基化作為最普遍且復(fù)雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，指在酶的催化下，單糖或寡糖鏈共價(jià)連接到蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)的過(guò)程，這層“糖衣”不僅塑造蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，更調(diào)控其生物活性、細(xì)胞定位與分子互作，貫穿胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答、信號(hào)傳導(dǎo)等幾乎所有核心生命過(guò)程，要了解這些功能，就需要知道精確的聚糖結(jié)構(gòu)，以及其結(jié)構(gòu)變異性、與蛋白質(zhì)的連接位點(diǎn)以及這些位點(diǎn)的占據(jù)程度等。
聚糖通常以糖蛋白或糖脂的形式存在于細(xì)胞上，它們分別與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)共價(jià)結(jié)合。連接兩個(gè)單糖的鍵稱為糖苷鍵。聚糖主要通過(guò)兩種主要連接方式與蛋白質(zhì)相連，一種是聚糖通過(guò)天冬酰胺的側(cè)鏈氮與蛋白質(zhì)連接（N-連接聚糖），另一種是通過(guò)絲氨酸或蘇氨酸的側(cè)鏈氧連接（O-連接聚糖）。在N-連接糖基化的情況下，糖鏈一般與Asn-X-Thr/Ser（X是除脯氨酸外的任何氨基酸）基序的受體天冬酰胺結(jié)合。最常見(jiàn)的O-連接糖基化將單個(gè)單糖GalNAc（粘蛋白型糖基化）或GlcNAc（O-GlcNAc糖基化）與蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸結(jié)合，沒(méi)有比較固定的連接基序，并且在GalNAc的情況下，這種單糖會(huì)進(jìn)一步延伸以形成各種核心聚糖結(jié)構(gòu)。
圖1 哺乳動(dòng)物中常見(jiàn)的蛋白質(zhì)糖基化類型（Ieva Bagdonaite, et al., 2022）
對(duì)于聚糖的全面分析主要分為兩個(gè)層次，第一個(gè)層次是僅對(duì)單個(gè)聚糖結(jié)構(gòu)及其異構(gòu)模式的詳細(xì)分析，即糖組學(xué)，需要將聚糖從糖蛋白上釋放出來(lái)，釋放的聚糖可以進(jìn)入質(zhì)譜分析，也可以結(jié)合其他衍生化和分析技術(shù)，如熒光標(biāo)記、全甲基化等，進(jìn)行深入的結(jié)構(gòu)表征。但由于聚糖已經(jīng)不再結(jié)合蛋白質(zhì)，所以無(wú)法研究特定于位點(diǎn)的信息。第二個(gè)層次是直接對(duì)糖蛋白上糖基化肽段、位點(diǎn)及糖型的表征，即糖蛋白質(zhì)組學(xué)，保留聚糖-多肽的完整結(jié)合（圖1）。從復(fù)雜生物樣本中測(cè)定糖、糖肽及糖鏈的結(jié)構(gòu)，可以借助核磁共振(NMR)、電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS)和毛細(xì)管電泳(CE)等多種不同的技術(shù)，而目前LC-MS/MS是糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究最常用的方法。
圖2 糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程（Asif Shajahan, et al., 2017）
糖組學(xué)分析
在糖組學(xué)分析中，使用N-聚糖切割酶從肽的天冬酰胺殘基上切割，釋放出的具有親水性的N-聚糖，可以使用C18固相萃取(SPE)柱等與O-連接的糖肽和非糖基化肽分離。隨后，O-連接的糖肽和非糖基化肽從C18 SPE中洗脫。由于缺乏對(duì)O-連接聚糖具有廣泛特異性的去糖基化酶，因此O-連接聚糖的釋放通常通過(guò)化學(xué)方法完成。用于釋放O-聚糖的常見(jiàn)化學(xué)方法包括還原性β-消除、基于氨的非還原性β-消除或肼解。為了實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測(cè)，O-連接和N-連接的聚糖組分在質(zhì)譜分析前通常會(huì)進(jìn)行衍生化，如全甲基化、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基吡啶(2-AP)、4-氨基苯甲酸或鄰氨基苯甲酸等進(jìn)行還原端標(biāo)記。衍生化（特別是全甲基化）可增強(qiáng)游離聚糖的離子化效率，通過(guò)糖苷鍵斷裂和跨環(huán)斷裂，能夠從串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）譜圖中提取更詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息。
圖3 全甲基化可區(qū)分聚糖同分異構(gòu)（Asif Shajahan, et al., 2017）
糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析
由于糖基化修飾蛋白在生物樣本中占比極低，糖肽僅占總肽段的5%以下，且易被大量高豐度非糖肽掩蓋，直接進(jìn)行質(zhì)譜分析難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)鑒定，因此需先通過(guò)富集技術(shù)特異性捕獲糖肽，再結(jié)合質(zhì)譜分析解析其詳細(xì)信息。常用的富集技術(shù)各有側(cè)重，其中凝集素親和層析憑借凝集素與特定糖鏈結(jié)構(gòu)的特異性識(shí)別能力，可針對(duì)性富集含對(duì)應(yīng)糖鏈的糖肽，且操作簡(jiǎn)便、兼容性強(qiáng)；親水相互作用色譜則基于糖肽與非糖肽的親疏水性差異，利用親水固定相將親水性更強(qiáng)的糖肽保留并分離，尤其適合富集弱酸性糖肽和短鏈糖肽，兩種技術(shù)可結(jié)合使用以提升富集效率與覆蓋面。其他方法包括免疫親和色譜法、酰肼法、硼酸法、二氧化鈦富集法等。
圖4 NEB凝集素親和N-糖肽結(jié)合蛋白
質(zhì)譜：糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)
質(zhì)譜分析作為糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)解析的核心環(huán)節(jié)，分析流程主要包括樣本預(yù)處理→富集（糖/糖肽）→離子化→質(zhì)譜分離與碎裂→譜圖解析（圖5）：
蛋白質(zhì)糖基化研究的意義
1. 揭示生命基本規(guī)律
結(jié)語(yǔ)
糖組學(xué)與糖蛋白質(zhì)組學(xué)正借助質(zhì)譜技術(shù)，逐步揭示糖類分子在生命過(guò)程中的核心作用。從基礎(chǔ)科研到臨床應(yīng)用，這一領(lǐng)域不僅拓展了我們對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)，更為疾病診斷、藥物研發(fā)提供了新的可能性。未來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷升級(jí)和人工智能的引入，糖組學(xué)研究將迎來(lái)更廣闊的應(yīng)用前景。我們的PEAKS GlycanFinder軟件可以提供糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確、全面的定性、定量分析結(jié)果，可以聯(lián)系我們深入交流，包括但不限于數(shù)據(jù)分析、實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)等。
參考文獻(xiàn)
作為生物信息學(xué)的領(lǐng)軍企業(yè)，BSI專注于蛋白質(zhì)組學(xué)和生物藥領(lǐng)域，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)和先進(jìn)算法提供世界領(lǐng)先的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件和蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)解決方案，以推進(jìn)生物學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn)。我們通過(guò)基于AI的計(jì)算方案，為您提供對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和醫(yī)學(xué)的卓越洞見(jiàn)。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數(shù)千家學(xué)術(shù)和工業(yè)用戶，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽組發(fā)現(xiàn)服務(wù)和抗體綜合表征服務(wù)等。
聯(lián)系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
聚糖通常以糖蛋白或糖脂的形式存在于細(xì)胞上，它們分別與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)共價(jià)結(jié)合。連接兩個(gè)單糖的鍵稱為糖苷鍵。聚糖主要通過(guò)兩種主要連接方式與蛋白質(zhì)相連，一種是聚糖通過(guò)天冬酰胺的側(cè)鏈氮與蛋白質(zhì)連接（N-連接聚糖），另一種是通過(guò)絲氨酸或蘇氨酸的側(cè)鏈氧連接（O-連接聚糖）。在N-連接糖基化的情況下，糖鏈一般與Asn-X-Thr/Ser（X是除脯氨酸外的任何氨基酸）基序的受體天冬酰胺結(jié)合。最常見(jiàn)的O-連接糖基化將單個(gè)單糖GalNAc（粘蛋白型糖基化）或GlcNAc（O-GlcNAc糖基化）與蛋白質(zhì)的絲氨酸或蘇氨酸結(jié)合，沒(méi)有比較固定的連接基序，并且在GalNAc的情況下，這種單糖會(huì)進(jìn)一步延伸以形成各種核心聚糖結(jié)構(gòu)。
圖1 哺乳動(dòng)物中常見(jiàn)的蛋白質(zhì)糖基化類型（Ieva Bagdonaite, et al., 2022）對(duì)于聚糖的全面分析主要分為兩個(gè)層次，第一個(gè)層次是僅對(duì)單個(gè)聚糖結(jié)構(gòu)及其異構(gòu)模式的詳細(xì)分析，即糖組學(xué)，需要將聚糖從糖蛋白上釋放出來(lái)，釋放的聚糖可以進(jìn)入質(zhì)譜分析，也可以結(jié)合其他衍生化和分析技術(shù)，如熒光標(biāo)記、全甲基化等，進(jìn)行深入的結(jié)構(gòu)表征。但由于聚糖已經(jīng)不再結(jié)合蛋白質(zhì)，所以無(wú)法研究特定于位點(diǎn)的信息。第二個(gè)層次是直接對(duì)糖蛋白上糖基化肽段、位點(diǎn)及糖型的表征，即糖蛋白質(zhì)組學(xué)，保留聚糖-多肽的完整結(jié)合（圖1）。從復(fù)雜生物樣本中測(cè)定糖、糖肽及糖鏈的結(jié)構(gòu)，可以借助核磁共振(NMR)、電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS)和毛細(xì)管電泳(CE)等多種不同的技術(shù)，而目前LC-MS/MS是糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究最常用的方法。
圖2 糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析流程（Asif Shajahan, et al., 2017）
糖組學(xué)分析
在糖組學(xué)分析中，使用N-聚糖切割酶從肽的天冬酰胺殘基上切割，釋放出的具有親水性的N-聚糖，可以使用C18固相萃取(SPE)柱等與O-連接的糖肽和非糖基化肽分離。隨后，O-連接的糖肽和非糖基化肽從C18 SPE中洗脫。由于缺乏對(duì)O-連接聚糖具有廣泛特異性的去糖基化酶，因此O-連接聚糖的釋放通常通過(guò)化學(xué)方法完成。用于釋放O-聚糖的常見(jiàn)化學(xué)方法包括還原性β-消除、基于氨的非還原性β-消除或肼解。為了實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測(cè)，O-連接和N-連接的聚糖組分在質(zhì)譜分析前通常會(huì)進(jìn)行衍生化，如全甲基化、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基吡啶(2-AP)、4-氨基苯甲酸或鄰氨基苯甲酸等進(jìn)行還原端標(biāo)記。衍生化（特別是全甲基化）可增強(qiáng)游離聚糖的離子化效率，通過(guò)糖苷鍵斷裂和跨環(huán)斷裂，能夠從串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）譜圖中提取更詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息。
圖3 全甲基化可區(qū)分聚糖同分異構(gòu)（Asif Shajahan, et al., 2017）糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析
由于糖基化修飾蛋白在生物樣本中占比極低，糖肽僅占總肽段的5%以下，且易被大量高豐度非糖肽掩蓋，直接進(jìn)行質(zhì)譜分析難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)鑒定，因此需先通過(guò)富集技術(shù)特異性捕獲糖肽，再結(jié)合質(zhì)譜分析解析其詳細(xì)信息。常用的富集技術(shù)各有側(cè)重，其中凝集素親和層析憑借凝集素與特定糖鏈結(jié)構(gòu)的特異性識(shí)別能力，可針對(duì)性富集含對(duì)應(yīng)糖鏈的糖肽，且操作簡(jiǎn)便、兼容性強(qiáng)；親水相互作用色譜則基于糖肽與非糖肽的親疏水性差異，利用親水固定相將親水性更強(qiáng)的糖肽保留并分離，尤其適合富集弱酸性糖肽和短鏈糖肽，兩種技術(shù)可結(jié)合使用以提升富集效率與覆蓋面。其他方法包括免疫親和色譜法、酰肼法、硼酸法、二氧化鈦富集法等。
圖4 NEB凝集素親和N-糖肽結(jié)合蛋白
質(zhì)譜：糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)
質(zhì)譜分析作為糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)解析的核心環(huán)節(jié)，分析流程主要包括樣本預(yù)處理→富集（糖/糖肽）→離子化→質(zhì)譜分離與碎裂→譜圖解析（圖5）：
1. 樣本預(yù)處理
先對(duì)生物樣本（組織、體液等）進(jìn)行蛋白提取、酶解（糖蛋白質(zhì)組學(xué)側(cè)重糖肽釋放，糖組學(xué)側(cè)重游離糖鏈/糖綴合物解離），去除雜質(zhì)干擾。
2. 特異性富集
糖蛋白質(zhì)組學(xué)需采用合適的方法特異性捕獲糖肽（排除非糖肽干擾）；糖組學(xué)可通過(guò)對(duì)應(yīng)富集手段分離純化糖鏈，提升檢測(cè)靈敏度。
3. 離子化
采用適配糖/糖肽特性的電離方式，常用電噴霧電離（ESI）與液相色譜聯(lián)用，適配復(fù)雜混合物、微量樣本。
4. 質(zhì)譜分離與碎裂
帶電離子進(jìn)入質(zhì)譜儀后，經(jīng)質(zhì)量分析器（飛行時(shí)間、軌道阱等）按質(zhì)荷比分離；再通過(guò)單一或組合碎裂模式（碰撞誘導(dǎo)解離、電子轉(zhuǎn)移解離等）將母離子碎裂，采集相應(yīng)的MS1和MS2譜圖信息。
5. 譜圖解析
結(jié)合專用軟件，匹配糖庫(kù)、肽段序列數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)解析（糖蛋白質(zhì)組學(xué)需鑒定糖蛋白、糖基化位點(diǎn)及糖鏈結(jié)構(gòu)，糖組學(xué)側(cè)重糖鏈精細(xì)結(jié)構(gòu)解析）；可結(jié)合報(bào)告離子標(biāo)記（TMT/iTRAQ）、非標(biāo)定量（Label-free）等技術(shù)，完成不同狀態(tài)下目標(biāo)物的差異定量，為功能研究提供依據(jù)，以及PRM技術(shù)靶向驗(yàn)證目標(biāo)糖肽。以上分析均可在PEAKS Glycanfinder中完成。
圖5 基于質(zhì)譜的糖蛋白質(zhì)組學(xué)（a）和糖組學(xué)（b）流程
蛋白質(zhì)糖基化研究的意義
1. 揭示生命基本規(guī)律
- 糖基化廣泛參與細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞黏附、免疫識(shí)別、胚胎發(fā)育等核心生命過(guò)程。
- 糖鏈結(jié)構(gòu)的多樣性與時(shí)空特異性，賦予蛋白質(zhì)精細(xì)的功能調(diào)控能力，是生命復(fù)雜性的重要分子基礎(chǔ)。
- 與核酸、蛋白質(zhì)共同構(gòu)成生命信息傳遞的 “第三條分子鏈”，完善對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)知。
- 許多重大疾病的發(fā)生、發(fā)展都伴隨異常糖基化，如腫瘤、炎癥、神經(jīng)退行性疾病、代謝疾病等。
- 糖基化異�？捎绊懙鞍追�(wěn)定性、定位、互作，直接參與細(xì)胞癌變、侵襲轉(zhuǎn)移、免疫逃逸等過(guò)程。
- 為從分子層面解釋疾病機(jī)制提供了傳統(tǒng)蛋白組學(xué)無(wú)法覆蓋的新維度。
- 糖基化修飾靈敏度高、變化早，是理想的疾病標(biāo)志物來(lái)源。
- 典型如AFP-L3（肝癌特異性糖基化異質(zhì)體），已成為臨床早期診斷與良惡性鑒別重要指標(biāo)。
- 基于糖基化譜可實(shí)現(xiàn)更精細(xì)的疾病分型、預(yù)后判斷、療效監(jiān)測(cè)，推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)。
- 抗體、激素、疫苗等重組蛋白藥物的療效、半衰期、免疫原性高度依賴糖基化。
- 糖基化優(yōu)化是生物藥質(zhì)量控制與藥效提升的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
- 為靶向藥物設(shè)計(jì)、抗感染疫苗、抗腫瘤療法提供全新靶點(diǎn)與策略。
- 糖基化連接基因組、蛋白質(zhì)組與表型組，填補(bǔ)了從基因到功能的關(guān)鍵缺口。
- 糖組學(xué)、糖蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，讓生命科學(xué)從線性信息走向多維、動(dòng)態(tài)、網(wǎng)絡(luò)化的系統(tǒng)研究。
結(jié)語(yǔ)
糖組學(xué)與糖蛋白質(zhì)組學(xué)正借助質(zhì)譜技術(shù)，逐步揭示糖類分子在生命過(guò)程中的核心作用。從基礎(chǔ)科研到臨床應(yīng)用，這一領(lǐng)域不僅拓展了我們對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)，更為疾病診斷、藥物研發(fā)提供了新的可能性。未來(lái)，隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷升級(jí)和人工智能的引入，糖組學(xué)研究將迎來(lái)更廣闊的應(yīng)用前景。我們的PEAKS GlycanFinder軟件可以提供糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確、全面的定性、定量分析結(jié)果，可以聯(lián)系我們深入交流，包括但不限于數(shù)據(jù)分析、實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)等。
參考文獻(xiàn)
- Shajahan A, Heiss C, Ishihara M, Azadi P. Glycomic and glycoproteomic analysis of glycoproteins-a tutorial. Anal Bioanal Chem. 2017 Jul;409(19):4483-4505. doi: 10.1007/s00216-017-0406-7. Epub 2017 Jun 6. PMID: 28585084; PMCID: PMC5498624.
- Bagdonaite, I., Malaker, S.A., Polasky, D.A. et al. Glycoproteomics. Nat Rev Methods Primers 2, 48 (2022). https://doi.org/10.1038/s43586-022-00128-4
作為生物信息學(xué)的領(lǐng)軍企業(yè)，BSI專注于蛋白質(zhì)組學(xué)和生物藥領(lǐng)域，通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)和先進(jìn)算法提供世界領(lǐng)先的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件和蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)解決方案，以推進(jìn)生物學(xué)研究和藥物發(fā)現(xiàn)。我們通過(guò)基于AI的計(jì)算方案，為您提供對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和醫(yī)學(xué)的卓越洞見(jiàn)。旗下著名的PEAKS®️系列軟件在全世界擁有數(shù)千家學(xué)術(shù)和工業(yè)用戶，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，ProteoformXTM,DeepImmu®️ 免疫肽組發(fā)現(xiàn)服務(wù)和抗體綜合表征服務(wù)等。
聯(lián)系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
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