圖 1｜MEA-seqX 跨尺度神經研究框。

MEA-seqX 在同一腦組織樣本中整合 3Barin 高分辨率微電極陣列電生理記錄、空間轉錄組測序和組織成像數(shù)據 (a–d)。通過空間配準將不同模態(tài)數(shù)據映射到統(tǒng)一的組織坐標系中 (e)，并進一步通過多模態(tài)計算分析解析神經網絡動力學、網絡拓撲結構及細胞類型特征 (g)，從而建立神經活動與基因表達之間的跨尺度關聯(lián)。

3Brain HD-MEA 記錄海馬–皮層腦片多區(qū)域神經網絡活動
研究團隊利用 3Brain 高分辨率微電極陣列平臺對小鼠海馬–皮層急性腦片進行大規(guī)模神經網絡電生理記錄，并行采集來自齒狀回 (DG)、Hilus、CA3、CA1以及內嗅皮層 (EC) 等多個腦區(qū)的神經活動信號（圖1a），構建具有空間坐標的神經網絡活動圖譜。隨后，研究者從局部場電位LFP信號中提取多種網絡活動特征，包括LFP 振幅 (amplitude)、事件頻率 (rate)、信號傳播延遲 (delay) 以及振蕩能量 (energy)，用于描述海馬網絡的整體活動模式（圖2a）。

研究團隊隨后將這些電生理特征與空間轉錄組數(shù)據進行比較分析。結果發(fā)現(xiàn)，在齒狀回和 CA3 等關鍵海馬區(qū)域，多種神經網絡活動指標與局部基因表達模式之間存在顯著空間關聯(lián)（圖2a）。在豐富環(huán)境 (enriched environment) 條件下，LFP 振幅和事件頻率等指標與基因表達之間的對應關系進一步增強，說明環(huán)境經驗能夠同時影響神經網絡活動與分子表達狀態(tài)（圖2a）。

除了量化神經網絡活動強度，研究團隊還對記錄到的 LFP 波形形態(tài)進行分類。通過主成分分析結合聚類算法，研究者識別出不同海馬層級中具有區(qū)域特征的振蕩波形模式（圖2b），揭示海馬網絡在空間上呈現(xiàn)出明顯的功能分層。

研究者進一步在網絡連接層面 (network connectivity) 分析電極之間的活動相關性 (pairwise firing correlation)，并據此構建海馬網絡的功能連接圖譜。結果顯示，在豐富環(huán)境條件下，海馬網絡的連接強度明顯增強，跨區(qū)域神經活動同步程度更高（圖2c）�；�于 LFP 信號構建的相關矩陣也呈現(xiàn)出類似趨勢，提示豐富環(huán)境條件下海馬網絡整體振蕩的協(xié)調性明顯提升（圖2d）。

在此基礎上，研究者進一步從網絡拓撲結構 (network topology) 的角度分析海馬網絡。通過圖論分析方法 (graph-theoretic analysis)，研究者識別出網絡中的高度連接節(jié)點 (hub nodes) 以及由這些節(jié)點組成的“富集俱樂部” (rich-club) 結構。結果顯示，在環(huán)境豐富化條件下，海馬網絡中出現(xiàn)更多高度連接的樞紐節(jié)點，并形成更明顯的rich-club 組織，表明不同海馬區(qū)域之間建立了更緊密的功能連接（圖2e）。
 

圖 2｜3Brain 高分辨率解析小鼠海馬體-皮層神經網絡活動

(a) 神經網絡活動與基因表達之間的空間關聯(lián)。橫軸表示不同的神經網絡活動特征（如 LFP 振幅、事件頻率、傳播延遲等），縱軸表示在空間轉錄組測序位點中 (SRT spot)，與這些電生理特征顯著相關的基因表達模式數(shù)量。灰色表示標準飼養(yǎng)條件 (SD)，藍色表示豐富環(huán)境條件 (ENR)。柱狀體越高，說明該網絡活動特征與更多基因表達存在空間關聯(lián)。

(b) 不同海馬區(qū)域的LFP波形模式�；疑�曲線表示檢測到的LFP振蕩事件的單次波形，彩色曲線表示該類事件的平均波形。橫軸為時間 (ms)，縱軸為電壓幅度 (µV)。

(c) 神經元共放電構成的網絡連接圖。矩陣中的每個方格表示成對放電電極之間神經元放電spike活動的相關性 (Pearson correlation coefficient, PCC)。顏色越深表示電極之間成對放電活動 (pairwise firing) 的相關性越高，反映更強的神經網絡連接。

(d) 海馬不同腦區(qū)之間的 LFP 活動相關性。柱狀圖展示不同腦區(qū)對之間LFP 信號的相關性 (PCC)。柱狀體越高表示兩個腦區(qū)之間的神經活動同步性越強。

(e) 海馬網絡連接的拓撲結構分析。圖中每個節(jié)點代表一個神經活動記錄位置，連線表示兩個節(jié)點之間存在顯著的神經活動相關性。為便于展示整體網絡結構，僅顯示約 2% 的連接關系（SD：node = 1057，links = 24217；ENR：node = 2003，links = 36312）。節(jié)點大小根據其連接度 (degree) 進行縮放，即該節(jié)點與其他節(jié)點建立連接的數(shù)量；節(jié)點越大表示其與更多節(jié)點存在功能連接。不同顏色表示節(jié)點所屬的海馬區(qū)域，彩色連線表示區(qū)域內或區(qū)域之間的功能連接。中間的圓形圖展示網絡中的關鍵節(jié)點結構，其中 hub nodes 表示具有較高連接度的節(jié)點，rich-club 表示這些高連接節(jié)點之間形成的高度互聯(lián)結構。左側為標準飼養(yǎng)條件 (SD)，右側為豐富環(huán)境 (ENR)。

機器學習進一步解析神經網絡動力學
在使用 3Brain HD-MEA 獲得大規(guī)模電生理數(shù)據后，研究團隊進一步通過計算分析與機器學習方法解析神經網絡的多尺度結構。首先，研究者采用非負矩陣分解 (Non-negative Matrix Factorization, NMF) 將復雜的網絡活動拆解為多個具有特定空間分布和時間特征的網絡模塊 (network modules)，從而識別不同海馬亞區(qū)之間的功能子網絡結構（圖3a）。

在此基礎上，研究者進一步分析神經活動在腦片中的傳播動態(tài)。通過計算神經活動傳播軌跡中心 (center of activity trajectory, CAT)，可以追蹤神經網絡活動在不同海馬區(qū)域之間的傳播方向，從而描繪海馬網絡中的信息傳播路徑（圖3b）。

隨后，研究團隊利用機器學習算法 XGBoost (Chen & Guestrin, 2016) 探索基因表達與神經網絡活動之間的預測關系。模型根據空間轉錄組數(shù)據預測多個關鍵電生理指標，例如LFP 事件頻率、振幅以及信號傳播延遲（原文附圖8）。預測結果與實際電生理測量值之間表現(xiàn)出較高一致性 (Pearson r ≈ 0.9)，說明神經網絡活動特征在很大程度上可以由基因表達模式進行預測。

圖 3｜機器學習解析神經網絡動力學

(a) 神經網絡活動與基因表達之間的空間關聯(lián)分布。圖中展示在不同海馬區(qū)域中，神經網絡活動特征 (LFP 事件頻率) 與多種神經功能相關基因表達之間的對應關系。每一列代表一個基因，每一行代表一個空間位置。顏色越深，表示該位置的神經網絡活動與該基因表達之間的關聯(lián)越強。上圖為標準飼養(yǎng)條件 (SD)，下圖為豐富環(huán)境條件 (ENR)。

(b) 非負矩陣分解識別的神經網絡–基因表達關聯(lián)模塊。研究者利用非負矩陣分解 (NMF) 將復雜的電生理特征與基因表達數(shù)據拆解為多個潛在因子 (NMF factors)。圖中每個小圖對應一個因子，曲線表示該因子在不同網絡活動特征中的貢獻權重。不同顏色表示該因子中貢獻最大的代表基因。

3D HD-MEA腦片電生理與多模態(tài)分析實驗流程
為系統(tǒng)研究神經網絡活動與基因表達之間的關系，研究團隊結合 3Brain HD-MEA 電生理記錄與空間轉錄組測序，構建跨尺度神經網絡功能圖譜。整體實驗流程如下 (具體 workflow 詳見原文附圖 1）。

01. 腦片制備與接種
小鼠海馬–皮層急性腦片（厚度約 300 μm）在氧合的人工腦脊液中制備，并在 34 °C 條件下孵育約 45 分鐘恢復組織活性，隨后在室溫下繼續(xù)恢復至少1 小時后用于電生理記錄。記錄過程中持續(xù)灌流氧合的記錄液（95% O₂ / 5% CO₂），以維持穩(wěn)定的離子環(huán)境和組織活性。

在記錄過程中，腦片通過鉑金固定框 (platinum harp) 穩(wěn)定放置于 3Brain 高分辨率微電極陣列芯片表面，并在恒溫灌流系統(tǒng)中進行記錄。灌流速率約為4.5 mL min⁻¹，記錄溫度維持在 37 °C，以保證腦片在長時間實驗過程中的穩(wěn)定性。

02. HD‑MEA 神經網絡電生理數(shù)據采集
在該系統(tǒng)中，芯片集成的放大電路提供 0.1–5 kHz 帶通濾波，并具有 60 dB 的全局增益 (global gain)，可同時記錄慢速與快速神經振蕩信號。細胞外電信號以 14 kHz / 電極的采樣率進行采集，每次實驗持續(xù)10 分鐘，連續(xù)記錄腦片中的細胞外電活動。

基于這些連續(xù)記錄的數(shù)據，研究者以 1 Hz 的時間分辨率提取神經網絡活動事件，即按每秒一次的時間尺度對網絡活動進行統(tǒng)計與分析。為增強網絡活動的興奮強度，在記錄液中加入100 μM 4AP以誘導網絡振蕩活動。

此外，系統(tǒng)集成了一套定制模塊化立體顯微鏡，在電生理記錄后對同一腦片進行光學成像。隨后通過 3Brain 配套軟件 BrainWave 將圖像與電極陣列數(shù)據進行疊加 (merge)，從而建立腦片組織結構與 HD-MEA 電極布局之間的空間對應關系，實現(xiàn)神經活動與腦區(qū)結構的精確對齊。

03. 神經網絡振蕩信號提取與波形分類
獲得原始電生理信號后，研究者首先從寬帶細胞外記錄中提取局部場電位LFP。隨后通過硬閾值檢測算法 (hard threshold algorithm) 識別網絡振蕩事件，并使用四階Butterworth 低通濾波器（一種常見的信號處理方法，用于保留低頻信號并去除高頻噪聲）在 1–100 Hz 頻段對信號進行濾波，以提取反映神經網絡群體活動的 LFP 振蕩信號。在此基礎上，對神經網絡活動的多個特征進行量化分析，包括LFP 事件發(fā)生頻率、振蕩振幅、振蕩能量、神經信號傳播延遲以及振蕩峰值數(shù)量，用于描述海馬網絡在不同空間位置的活動模式。

為了進一步比較不同腦區(qū)之間的振蕩特征，研究者對記錄到的 LFP 波形進行模式分類分析。具體而言，通過主成分分析 (principal component analysis, PCA) 提取波形的主要特征，再結合 K-means 聚類算法對振蕩波形進行分組，從而識別不同海馬結構層級中具有代表性的振蕩模式及其空間分布。

04. 電生理特征與空間轉錄組數(shù)據整合分析
為分析神經網絡活動與基因表達模式之間的關系，研究者將提取的電生理網絡特征與同一腦片獲得的空間轉錄組數(shù)據進行整合分析。首先，通過 Spearman 相關分析評估不同空間位置的基因表達模式與神經網絡活動特征之間的關聯(lián)程度，以量化轉錄組表達譜系與電生理活動之間的空間對應關系。

在此基礎上，進一步利用 XGBoost 機器學習模型對神經網絡電生理特征進行預測分析 (Chen & Guestrin, 2016)。模型以約 70% 的空間轉錄組數(shù)據作為訓練集，用于學習基因表達模式與神經網絡活動之間的關系，并以剩余數(shù)據進行預測評估。預測的網絡活動指標包括LFP事件頻率、振蕩振幅以及神經信號傳播延遲等特征，用于分析轉錄組表達模式與神經網絡動力學之間的多尺度關聯(lián)。