DAP-seq技術(shù)助力揭示獨腳金內(nèi)酯調(diào)控蘋果腋芽生長的分子機制
2025年10月14日，中國農(nóng)業(yè)大學李威教授團隊在Plant Physiology（IF=6.9）上發(fā)表了一篇題為“Strigolactones inhibit axillary bud outgrowth through transcription factor MdSPL6-mediated regulation of ABA levels in apple”的研究論文。該研究借助DAP-seq技術(shù)，揭示了獨腳金內(nèi)酯通過MdSPL6-MdSMXL7模塊調(diào)控下游靶基因，進而介導脫落酸積累以抑制蘋果側(cè)芽生長的完整信號通路，為蘋果株型改良和高產(chǎn)育種提供了關(guān)鍵基因靶點和理論依據(jù)。藍景科信為該研究提供了DAP-seq技術(shù)支持。
側(cè)枝發(fā)育是影響植物株型構(gòu)建和作物產(chǎn)量的關(guān)鍵形態(tài)特征，蘋果腋芽的休眠特性往往制約其早分枝進程與果實生產(chǎn)效率。植物激素在腋芽生長調(diào)控中發(fā)揮核心作用，其中獨腳金內(nèi)酯（SLs）作為類胡蘿卜素衍生激素，已被證實是抑制植物分枝的關(guān)鍵因子，但其在多年生木本植物（如蘋果）中的分子調(diào)控機制尚未完全闡明�，F(xiàn)有研究表明，SLs信號通路的關(guān)鍵抑制因子SMXL與SPL轉(zhuǎn)錄因子存在相互作用，但蘋果中SPL基因是否直接調(diào)控分枝、SLs與脫落酸（ABA）在腋芽休眠調(diào)控中的協(xié)同作用機制仍有待明確。因此，解析SLs調(diào)控蘋果腋芽生長的分子網(wǎng)絡(luò)，明確關(guān)鍵基因功能及激素互作關(guān)系，對蘋果株型改良和產(chǎn)量提升相關(guān)研究具有重要的實踐意義。
主要研究結(jié)果
核心發(fā)現(xiàn)一：驗證獨腳金內(nèi)酯對蘋果側(cè)芽生長的抑制作用
研究團隊采用不同濃度SLs合成類似物rac-GR24處理去頂蘋果枝條，同時設(shè)置DMSO對照組及不去頂對照組進行對比，持續(xù)觀測不同節(jié)位側(cè)芽的長度與萌發(fā)率。結(jié)果顯示，rac-GR24處理組的腋芽長度顯著短于對照組（11天時長僅為對照組的31.25%），且多節(jié)點腋芽的萌發(fā)率也呈現(xiàn)顯著降低趨勢（第4、5節(jié)點無萌發(fā)），證實SLs能有效抑制蘋果腋芽的萌發(fā)與伸長。
主要研究結(jié)果
核心發(fā)現(xiàn)一：驗證獨腳金內(nèi)酯對蘋果側(cè)芽生長的抑制作用
研究團隊采用不同濃度SLs合成類似物rac-GR24處理去頂蘋果枝條，同時設(shè)置DMSO對照組及不去頂對照組進行對比，持續(xù)觀測不同節(jié)位側(cè)芽的長度與萌發(fā)率。結(jié)果顯示，rac-GR24處理組的腋芽長度顯著短于對照組（11天時長僅為對照組的31.25%），且多節(jié)點腋芽的萌發(fā)率也呈現(xiàn)顯著降低趨勢（第4、5節(jié)點無萌發(fā)），證實SLs能有效抑制蘋果腋芽的萌發(fā)與伸長。
圖1 rac-GR24處理對蘋果腋芽生長的抑制效應(yīng)
核心發(fā)現(xiàn)二：解析獨腳金內(nèi)酯（SLs）信號通路調(diào)控機制
1、鎖定SLs調(diào)控蘋果腋芽生長的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子
研究團隊通過酵母雙雜交篩選蘋果側(cè)芽cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)SLs信號通路關(guān)鍵抑制子MdSMXL7與SPL轉(zhuǎn)錄因子MD06G1204000（MdSPL6）存在相互作用。隨后，研究團隊利用酵母雙雜交、雙分子熒光互補、熒光素酶互補成像及體外pull-down等多項實驗，結(jié)合亞細胞定位與轉(zhuǎn)錄激活分析，進一步證實SLs信號通路抑制因子MdSMXL7與轉(zhuǎn)錄因子MdSPL6可在細胞核內(nèi)直接相互作用。研究團隊通過CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建Mdspl6突變體后開展表型分析，結(jié)果顯示突變體側(cè)枝數(shù)量顯著增加。以上結(jié)果證明，MdSPL6是蘋果腋芽生長的負調(diào)控因子，且其具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
1、鎖定SLs調(diào)控蘋果腋芽生長的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子
研究團隊通過酵母雙雜交篩選蘋果側(cè)芽cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)SLs信號通路關(guān)鍵抑制子MdSMXL7與SPL轉(zhuǎn)錄因子MD06G1204000（MdSPL6）存在相互作用。隨后，研究團隊利用酵母雙雜交、雙分子熒光互補、熒光素酶互補成像及體外pull-down等多項實驗，結(jié)合亞細胞定位與轉(zhuǎn)錄激活分析，進一步證實SLs信號通路抑制因子MdSMXL7與轉(zhuǎn)錄因子MdSPL6可在細胞核內(nèi)直接相互作用。研究團隊通過CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建Mdspl6突變體后開展表型分析，結(jié)果顯示突變體側(cè)枝數(shù)量顯著增加。以上結(jié)果證明，MdSPL6是蘋果腋芽生長的負調(diào)控因子，且其具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
圖2 MdSMXL7與MdSPL6相互作用的驗證
圖3 蘋果MdSPL6的功能分析
2、全基因組范圍鑒定MdSPL6下游靶基因
為鑒定MdSPL6下游靶基因，本研究開展了DNA親和純化測序（DAP-seq）。結(jié)果顯示MdSPL6在蘋果基因組中存在11127個高置信度結(jié)合峰，其核心結(jié)合基序為GTAC，該基序也是不同物種SPL轉(zhuǎn)錄因子中的保守序列。GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示，MdSPL6的靶基因顯著富集于植物激素信號轉(zhuǎn)導通路，其中在脫落酸（ABA）相關(guān)通路中富集尤為明顯。研究團隊據(jù)此進一步篩選出MdHB53和MdTCP1為關(guān)鍵候選靶基因。
為鑒定MdSPL6下游靶基因，本研究開展了DNA親和純化測序（DAP-seq）。結(jié)果顯示MdSPL6在蘋果基因組中存在11127個高置信度結(jié)合峰，其核心結(jié)合基序為GTAC，該基序也是不同物種SPL轉(zhuǎn)錄因子中的保守序列。GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示，MdSPL6的靶基因顯著富集于植物激素信號轉(zhuǎn)導通路，其中在脫落酸（ABA）相關(guān)通路中富集尤為明顯。研究團隊據(jù)此進一步篩選出MdHB53和MdTCP1為關(guān)鍵候選靶基因。
圖4 通過DNA親和純化測序（DAP-seq）鑒定MdSPL6的靶基因
核心發(fā)現(xiàn)三：解析ABA積累抑制蘋果側(cè)芽生長的完整信號通路
1、鎖定ABA為SL-MdSPL6通路調(diào)控腋芽生長的關(guān)鍵下游介質(zhì)
研究團隊通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測rac-GR24處理后腋芽激素含量，發(fā)現(xiàn)處理后ABA水平顯著上升，而IAA、ZR、GA₃含量則呈顯著下降趨勢；過表達實驗進一步證實，MdSPL6過表達可引起愈傷組織中ABA含量大幅增加，表明MdSPL6可能通過調(diào)控ABA的合成來抑制腋芽生長。此外，外源ABA處理實驗結(jié)果顯示，其能顯著抑制腋芽伸長；而ABA合成抑制劑氟啶酮處理，則能促進腋芽生長。以上結(jié)果表明，SLs可通過MdSPL6促進ABA的積累，而ABA是抑制蘋果側(cè)芽生長的直接效應(yīng)因子。
1、鎖定ABA為SL-MdSPL6通路調(diào)控腋芽生長的關(guān)鍵下游介質(zhì)
研究團隊通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測rac-GR24處理后腋芽激素含量，發(fā)現(xiàn)處理后ABA水平顯著上升，而IAA、ZR、GA₃含量則呈顯著下降趨勢；過表達實驗進一步證實，MdSPL6過表達可引起愈傷組織中ABA含量大幅增加，表明MdSPL6可能通過調(diào)控ABA的合成來抑制腋芽生長。此外，外源ABA處理實驗結(jié)果顯示，其能顯著抑制腋芽伸長；而ABA合成抑制劑氟啶酮處理，則能促進腋芽生長。以上結(jié)果表明，SLs可通過MdSPL6促進ABA的積累，而ABA是抑制蘋果側(cè)芽生長的直接效應(yīng)因子。
圖5 rac-GR24處理及MdSPL6過表達對蘋果內(nèi)源激素水平的影響
2、MdSPL6通過靶基因MdTCP18和MdHB53調(diào)控ABA水平的分子路徑
為進一步研究MdSPL6調(diào)控ABA水平的分子路徑，研究團隊通過酵母單雜交、DAP-qPCR、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灱半娪具w移率變動分析，驗證了MdSPL6可直接轉(zhuǎn)錄激活MdHB53和MdTCP18，且rac-GR24處理可上調(diào)這兩個基因的表達；而MdSMXL7可抑制MdSPL6的轉(zhuǎn)錄激活功能，rac-GR24則能通過促進MdSMXL7降解，解除該抑制作用。
研究團隊隨后在蘋果愈傷組織和擬南芥中開展過表達實驗，檢測ABA水平及分枝表型。結(jié)果顯示，過表達MdHB53能顯著提升ABA水平，并直接激活ABA合成相關(guān)基因MdNCED1的轉(zhuǎn)錄；過表達MdTCP18則可恢復擬南芥bre1bre2突變體的分枝表型，同時提高其體內(nèi)ABA水平。以上結(jié)果表明，MdHB53通過調(diào)控MdNCED1介導ABA合成，MdTCP18通過ABA代謝影響分枝發(fā)育，兩者共同參與SL-MdSPL6通路對蘋果腋芽生長的抑制過程。
為進一步研究MdSPL6調(diào)控ABA水平的分子路徑，研究團隊通過酵母單雜交、DAP-qPCR、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灱半娪具w移率變動分析，驗證了MdSPL6可直接轉(zhuǎn)錄激活MdHB53和MdTCP18，且rac-GR24處理可上調(diào)這兩個基因的表達；而MdSMXL7可抑制MdSPL6的轉(zhuǎn)錄激活功能，rac-GR24則能通過促進MdSMXL7降解，解除該抑制作用。
研究團隊隨后在蘋果愈傷組織和擬南芥中開展過表達實驗，檢測ABA水平及分枝表型。結(jié)果顯示，過表達MdHB53能顯著提升ABA水平，并直接激活ABA合成相關(guān)基因MdNCED1的轉(zhuǎn)錄；過表達MdTCP18則可恢復擬南芥bre1bre2突變體的分枝表型，同時提高其體內(nèi)ABA水平。以上結(jié)果表明，MdHB53通過調(diào)控MdNCED1介導ABA合成，MdTCP18通過ABA代謝影響分枝發(fā)育，兩者共同參與SL-MdSPL6通路對蘋果腋芽生長的抑制過程。
圖6 MdSPL6對MdHB53和MdTCP18表達的調(diào)控
圖7 MdHB53和MdTCP18參與蘋果腋芽的調(diào)控
小結(jié)
小結(jié)
本研究首次完整闡明了“SLs-MdSMXL7-MdSPL6-MdHB53/MdTCP18-ABA”的級聯(lián)調(diào)控通路在蘋果腋芽生長中的作用機制，揭示了SLs與ABA信號在木本植物中的協(xié)同調(diào)控模式，填補了多年生果樹分枝調(diào)控分子機制研究的相關(guān)空白。同時，該研究為后續(xù)通過基因編輯、分子標記輔助育種等技術(shù)開展蘋果分枝特性定向改良研究提供了核心的基因靶點參考。
圖8 獨腳金內(nèi)酯（SLs）通過MdSPL6-MdSMXL7介導調(diào)控蘋果腋芽生長的作用模型
標簽：
DAP-seq
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