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DAP-seq實(shí)用研究思路助力植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究

瀏覽次數(shù):251 發(fā)布日期:2026-3-23  來(lái)源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
在植物科學(xué)領(lǐng)域,解析轉(zhuǎn)錄因子與DNA的互作機(jī)制是構(gòu)建基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心,更是揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境適應(yīng)等生命過(guò)程分子機(jī)制的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的ChIP-seq技術(shù)依賴高質(zhì)量特異性抗體,這一局限性使非模式植物的研究面臨巨大挑戰(zhàn)。DAP-seq(DNA Affinity Purification Sequencing,DNA親和純化測(cè)序)技術(shù)的出現(xiàn),為研究模式和非模式植物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究提供了高效、精準(zhǔn)的解決方案。本文將系統(tǒng)解析三種基于DAP-seq的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究思路,以期為相關(guān)領(lǐng)域的科研工作者提供有益的思路與啟發(fā)。
一、技術(shù)介紹
(一)核心原理
DAP-seq通過(guò)體外表達(dá)出含有標(biāo)簽(如His、Halo標(biāo)簽)的目的蛋白,利用標(biāo)簽特異性配體純化蛋白,再與基因組DNA片段孵育結(jié)合,然后富集與目的蛋白結(jié)合的DNA,經(jīng)高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析,在全基因組范圍內(nèi)鑒定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)。該技術(shù)無(wú)需目的蛋白特異性抗體,無(wú)需轉(zhuǎn)基因材料,即可揭示轉(zhuǎn)錄因子與DNA的互作網(wǎng)絡(luò)。
(二)藍(lán)景科信DAP-seq技術(shù)路線圖 
 
(三)技術(shù)優(yōu)勢(shì)
自2016年在《Cell》發(fā)表,2017年《Nature Protocols》發(fā)布標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)方法以來(lái),DAP-seq迅速成為解析轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵技術(shù)。截至目前,藍(lán)景科信使用該技術(shù),已助力科學(xué)家在植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)、果實(shí)發(fā)育、系統(tǒng)進(jìn)化等多個(gè)研究方向取得突破,相關(guān)研究成果發(fā)表于Cell、Molecular Plant、Plant Biotechnology Journal、Plant Cell、PNAS、Plant Communications、New Phytologist、Plant Physiology等知名期刊。
二、三大實(shí)用研究思路與藍(lán)景科信案例解析
(一)研究思路一:DAP-seq + 下游驗(yàn)證——精準(zhǔn)鎖定靶基因調(diào)控關(guān)系
該思路以 “全基因組篩選 + 靶向驗(yàn)證” 為核心,先通過(guò)DAP-seq定位轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),結(jié)合RNA-seq篩選差異表達(dá)靶基因,再經(jīng)體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證直接調(diào)控關(guān)系,是最基礎(chǔ)且高效的研究框架。這是DAP-seq最基礎(chǔ)且高效的研究框架,通過(guò)“全基因組篩選+靶向驗(yàn)證”的流程,明確轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的直接調(diào)控關(guān)系。
 
篩選階段:利用DAP-seq定位轉(zhuǎn)錄因子的全基因組結(jié)合位點(diǎn),結(jié)合RNA-seq篩選基因表達(dá)差異顯著的靶標(biāo),通過(guò)聯(lián)合分析縮小核心調(diào)控基因范圍。
驗(yàn)證階段:體外通過(guò)EMSA(凝膠遷移實(shí)驗(yàn))、Y1H(酵母單雜)驗(yàn)證蛋白與DNA的特異性結(jié)合,體內(nèi)通過(guò)ChIP-qPCR(染色質(zhì)免疫共沉淀-實(shí)時(shí)熒光定量PCR)、Dual-LUC(雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè))確認(rèn)調(diào)控關(guān)系。
案例1紫花苜蓿MsMYB35調(diào)控花藥發(fā)育研究
 
文章題目:Anther-specific expression of MsMYB35 transcription factor in alfalfa (Medicago sativa L.) and its crucial role in pollen development
發(fā)表期刊和時(shí)間:The Plant Journal(2025)
技術(shù)組合:DAP-seq、RNA-seq、Y1H、Dual-LUC
核心發(fā)現(xiàn):DAP-seq鑒定出14,992個(gè)結(jié)合峰,其中8,097個(gè)高可靠性位點(diǎn)富集于基因間區(qū)(62.7%)和啟動(dòng)子區(qū)(16.6%),富集到AAAAA、TAAC、GA(A/G)三類保守基序,對(duì)應(yīng)3,647個(gè)靶基因;聯(lián)合RNA-seq篩選出467個(gè)直接調(diào)控基因,富集于苯丙烷代謝、茉莉酸(JA)合成、細(xì)胞壁重塑(如果膠裂解酶通路)等花藥發(fā)育相關(guān)通路。酵母單雜交(Y1H)實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(Dual-LUC)證實(shí)MsMYB35可結(jié)合并激活MsJMTMsPL基因表達(dá),過(guò)表達(dá)MsMYB35促進(jìn)花藥發(fā)育,沉默則導(dǎo)致花粉不育,外源MeJA可恢復(fù)育性。
科學(xué)價(jià)值:本研究明確了MsMYB35的核心調(diào)控作用,為紫花苜蓿分子育種和雜交制種提供理論支撐。
  
案例2軟棗獼猴桃花青素調(diào)控機(jī)制研究
 
文章題目:Chromosome-level genome assembly assisting for dissecting mechanism of anthocyanin regulation in kiwifruit (Actinidia arguta)
發(fā)表期刊和時(shí)間:Molecular Horticulture(2025)
技術(shù)應(yīng)用:DAP-seq、RNA-seq、EMSA、Y1H、ChIP-qPCR、Dual-LUC
核心發(fā)現(xiàn):組裝首個(gè)全紅軟棗獼猴桃染色體水平基因組,通過(guò)對(duì)不同顏色的軟棗獼猴桃品種進(jìn)行RNA-seq分析,篩選出花青素抑制因子AaBEE1;DAP-seq鑒定AaBEE1在全基因組范圍內(nèi)的457個(gè)結(jié)合峰,靶基因顯著富集于黃酮類生物合成通路,其中LDOX基因與果實(shí)顏色緊密相關(guān)。通過(guò)Y1H、EMSA、ChIP-qPCR和LUC等實(shí)驗(yàn)證實(shí)AaBEE1通過(guò)結(jié)合AaLDOX啟動(dòng)子的G-box區(qū)域抑制其表達(dá),且AaLDOX啟動(dòng)子的29-bp indel 變異可影響基因表達(dá)效率。
  
研究思路二:DAP-seq + 互作蛋白——解析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)協(xié)同機(jī)制
在明確靶基因調(diào)控關(guān)系的基礎(chǔ)上,結(jié)合蛋白互作研究可豐富調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性解析。該思路以DAP-seq和RNA-seq篩選靶基因?yàn)楹诵,整合Y2H、Co-IP、蛋白Pull-down、BiFC等蛋白互作研究技術(shù),揭示轉(zhuǎn)錄因子與其他蛋白的協(xié)同作用模式,深化對(duì)調(diào)控機(jī)制的理解。
 
蛋白互作研究方法
酵母雙雜交(Y2H)作為經(jīng)典的蛋白互作研究方法,利用酵母轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征,通過(guò)觀察酵母在營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況或顯色活性判斷蛋白互作.
免疫共沉淀(Co-IP)可在細(xì)胞內(nèi)天然狀態(tài)下捕獲相互作用蛋白,通過(guò)WesternBlotting或質(zhì)譜進(jìn)行分析。
蛋白Pull down是體外研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法,基于親和層析原理,將誘餌蛋白與特定標(biāo)簽形成融合蛋白進(jìn)行表達(dá)純化,進(jìn)而捕獲并鑒定與之相互作用的蛋白。
雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)則能直觀判斷目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中的定位和相互作用。
熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(LCI)可通過(guò)檢測(cè)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度評(píng)估蛋白間相互作用及強(qiáng)度。
案例3:擬南芥雄性育性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析
 
文章標(biāo)題:A DELLA-ANAC106 reciprocal negative feedback circuit modulates gibberellin homeostasis to regulate male fertility in Arabidopsis
發(fā)表期刊和時(shí)間:New Phytologist(2025)
技術(shù)應(yīng)用:DAP-seq、RNA-seq、EMSA、Dual-LUC、Y2H、CO-IP
核心發(fā)現(xiàn):本研究鑒定出NAC轉(zhuǎn)錄因子ANAC106,它在擬南芥幼嫩花藥中高表達(dá),其過(guò)表達(dá)或顯性負(fù)抑制均會(huì)導(dǎo)致絨氈層降解異常(提前或延遲),進(jìn)而引發(fā)雄性不育。借助DAP-seq結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)分析,研究鎖定ANAC106的直接靶標(biāo)為GA合成基因GA3ox2/4和分解基因GA2ox1;EMSA與Dual-LUC實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),ANAC106可激活GA3ox2/4的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)Y2H和Co-IP顯示ANAC106與4種DELLA蛋白(RGA、GAI等)互作,互作區(qū)域?yàn)锳NAC106的N端,且DELLA蛋白以劑量依賴方式抑制ANAC106活性。二者形成雙向負(fù)反饋回路,通過(guò)調(diào)控GA穩(wěn)態(tài)維持雄性育性。
 
案例4:番茄果實(shí)成熟調(diào)控機(jī)制研究
 
文章標(biāo)題:Protein phosphatase PP2C2 dephosphorylates transcription factor ZAT5 and modulates tomato fruit ripening
發(fā)表期刊和時(shí)間:Plant Physiology(2025)
技術(shù)應(yīng)用:DAP-seq、RNA-seq、Y1H、EMSA、ChIP-qPCR、Dual-LUC、Y2H、CO-IP、BiFC、LCI、蛋白pull-down
核心發(fā)現(xiàn):SlZAT5負(fù)調(diào)控番茄果實(shí)成熟,DAP-seq結(jié)合RNA-seq鑒定到1511個(gè)成熟相關(guān)靶基因(含SlACS4、SlPL8、SlGRAS38等關(guān)鍵基因),經(jīng)Y1H、Dual-LUC、ChIP-qPCR和EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)SlZAT5可直接結(jié)合這些基因啟動(dòng)子并抑制其表達(dá);。進(jìn)一步通過(guò)Y2H篩選出SlZAT5的互作蛋白SlPP2C2,經(jīng)BiFC、LCI、蛋白pull-down、Co-IP及亞細(xì)胞共定位實(shí)驗(yàn)確認(rèn)二者在細(xì)胞核內(nèi)相互作用,SlPP2C2通過(guò)去磷酸化SlZAT5的Ser-65位點(diǎn),調(diào)控其轉(zhuǎn)錄抑制活性,進(jìn)而影響乙烯合成與果實(shí)成熟。
 

研究思路三:DAP-seq+多組學(xué)聯(lián)用——拓展研究深度與廣度
將DAP-seq與ATAC-seq等多組學(xué)技術(shù)結(jié)合,從DNA結(jié)合、染色質(zhì)可及性、基因表達(dá)等多維度解析調(diào)控機(jī)制,拓展研究的深度與廣度,尤其適用于復(fù)雜性狀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析。
案例5:小麥氮高效利用與產(chǎn)量提升機(jī)制研究
 
 
文章題目:An incoherent feed-forward loop coordinates nitrate uptake and tillering in wheat
發(fā)表期刊和時(shí)間:Molecular Plant(2025)
技術(shù)應(yīng)用:DAP-seq、ATAC-seq、RNA-seq、ChIP-qPCR、Y2H、Co-IP、BiFC、Y1H
核心發(fā)現(xiàn):TaNLP3是硝酸鹽響應(yīng)核心調(diào)控因子,與TaLBD38、TaNRT2.1構(gòu)成非一致性前饋環(huán)路;Y2H證實(shí)TaNLP3與SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物互作;ATAC-seq與DAP-seq聯(lián)合分析顯示,TaNLP3缺失顯著降低硝酸鹽誘導(dǎo)的染色質(zhì)可及性,共調(diào)控4008個(gè)靶基因,參與氮吸收、同化等過(guò)程。同時(shí)鑒定的優(yōu)異單倍型(TaNLP3-3BHap2等)為小麥高產(chǎn)高效育種提供遺傳資源。 
 
藍(lán)景科信:轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究的卓越合作伙伴
藍(lán)景科信深耕功能基因組學(xué)領(lǐng)域,累計(jì)完成260+物種,4000+轉(zhuǎn)錄因子的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,憑借高質(zhì)量的服務(wù),已助力合作客戶在Cell,Science,Molecular Plant,Plant Biotechnology Journal,Journal of Advanced Research,Plant Cell,PNAS等數(shù)十知名期刊發(fā)表高質(zhì)量研究成果。
我們的核心服務(wù)體系涵蓋 DAP-seq及ATAC-seq、RNA-seq等組學(xué)技術(shù),同時(shí)配套EMSA、Y1H、ChIP-qPCR、Dual-LUC等下游驗(yàn)證方案,并提供Y2H、Co-IP、蛋白Pull-down等全套蛋白互作服務(wù)。打造“組學(xué)檢測(cè)—功能驗(yàn)證—互作分析” 一站式轉(zhuǎn)錄因子研究解決方案,全方位支撐科研工作高效推進(jìn)!
 
發(fā)布者:藍(lán)景科信河北生物科技有限公司
聯(lián)系電話:15632249798
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