本文來源于微信公眾： 生物世界 作者：生物世界

撰文丨王聰
編輯丨王多魚
排版丨水成文

經(jīng)過基因工程改造、重編程以表達(dá)嵌合抗原受體（CAR）的 CAR-T 細(xì)胞療法，已徹底改變了癌癥治療格局，目前，美國 fDA 已批準(zhǔn)了款 CAR-T 細(xì)胞療法，用于治療包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤在內(nèi)的復(fù)發(fā)或難治性癌癥。最近，CAR-T 細(xì)胞療法還在系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身免疫疾病中展現(xiàn)了強(qiáng)大的治療潛力。

通過基因組編輯增強(qiáng) T 細(xì)胞功能，無論是通過破壞內(nèi)源性基因還是精確插入 DNA 片段，都已展現(xiàn)出相當(dāng)大的前景。然而，CAR-T 細(xì)胞的體外制造過程周期漫長且成本高昂，限制了這些療法的可及性。

在體內(nèi)原位生成 CAR-T 細(xì)胞，即所謂的 in vivo CAR-T 技術(shù)，能夠克服上述障礙，但目前的方法要么依賴于持續(xù)時(shí)間有限的瞬時(shí)表達(dá)（使用 LNP 遞送 mRNA ），要么依賴于缺乏特異性的 DNA 負(fù)載隨機(jī)整合（慢病毒載體遞送 DNA）。

2026 年 3 月 18 日，加州大學(xué)舊金山分校研究人員在國際頂尖學(xué)術(shù)期刊 Nature 上發(fā)表了題為：In vivo site-specific engineering to reprogram T cells 的研究論文。

該研究開發(fā)了一種雙載體系統(tǒng)——使用包膜遞送載體（EDV）和腺相關(guān)病毒（AAV）分別遞送 CRISPR–Cas9 RNP 和 CAR 模板，將 CAR 高效且特異性整合到 T 細(xì)胞的 TRAC 位點(diǎn)，在人源化小鼠模型的 B 細(xì)胞發(fā)育不全、血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤中體內(nèi)生成了治療水平的 CAR-T 細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)為更高效、更精準(zhǔn)且更廣泛可及的 T 細(xì)胞療法開辟了新途徑。

核心原理：雙載體系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)體內(nèi)精準(zhǔn)改造
在這項(xiàng)最新研究中，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一套創(chuàng)新的“雙載體系統(tǒng)”——
1、EDV（包膜遞送載體）：負(fù)責(zé)將 CRISPR-Cas9 基因編輯工具（以 RNP 的形式）精準(zhǔn)遞送到 T 細(xì)胞中，定點(diǎn)切割 T 細(xì)胞受體基因（TRAC 位點(diǎn)）。
2、AAV（腺相關(guān)病毒）：攜帶 CAR 基因模板（以 DNA 的形式），在切割位點(diǎn)通過同源定向修復(fù)機(jī)制，將 CAR 精準(zhǔn)插入 TRAC 位點(diǎn)。

這種設(shè)計(jì)的精妙之處在于，CAR 沒有自帶啟動(dòng)子，而是利用 T 細(xì)胞自身的 TRAC 啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)表達(dá)，確保了 CAR 只在 T 細(xì)胞中特異性表達(dá)，避免了誤傷其他細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。利用 T 細(xì)胞自身的 TRAC 的啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng) CAR 的表達(dá)，其表達(dá)水平也更接近天然 T 細(xì)胞激活的模式，可能有助于 CAR-T 細(xì)胞在體內(nèi)更好地維持功能、減少耗竭，從而更持久地發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，TRAC 位點(diǎn)也是一個(gè)被廣泛驗(yàn)證了的 T 細(xì)胞編輯的“安全港”位點(diǎn)，在此位點(diǎn)插入外源基因，對(duì) T 細(xì)胞的干擾更小、安全性更高。

技術(shù)優(yōu)化：三大屏障的攻克
為了提升體內(nèi)編輯的效率和安全性，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)載體進(jìn)行了三項(xiàng)關(guān)鍵優(yōu)化——
1、中和抗體抵抗：通過定向進(jìn)化改造 AAV 病毒衣殼，使其能抵抗人體血清中的中和抗體，確保 CAR 的有效遞送。
2、T 細(xì)胞特異性靶向：改造 EDV，使其表面展示了抗 CD3 抗體，從而精準(zhǔn)結(jié)合到 T 細(xì)胞，同時(shí)激活 T 細(xì)胞促進(jìn)其增殖，為基因編輯創(chuàng)造有利條件。
3、脫靶風(fēng)險(xiǎn)控制：優(yōu)化后的 AAV-hT7 載體幾乎不感染造血干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，從源頭避免了脫靶基因編輯可能導(dǎo)致的潛在白血病風(fēng)險(xiǎn)或腫瘤抗原丟失。

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：高效抗腫瘤效果
在多種人源化小鼠模型中，這種優(yōu)化的 EDV/AAV 雙載體系統(tǒng)成功在體內(nèi)生成了大量 CAR-T 細(xì)胞，占脾臟 T 細(xì)胞的近 20%。在 B 細(xì)胞發(fā)育不全的人源化小鼠模型中，這些體內(nèi)直接生成的 CAR-T 細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了完全的 B 細(xì)胞清除；在 B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血�。˙-ALL）、骨髓瘤以及肉瘤的人源化小鼠模型中，這些體內(nèi)直接生成的 CAR-T 細(xì)胞有效控制了腫瘤生長。進(jìn)一步細(xì)胞表型分析顯示，這些體內(nèi)直接生成的 CAR-T 細(xì)胞高度增殖，并保持了記憶細(xì)胞特征，預(yù)示著持久的治療效果。

這些結(jié)果表明，優(yōu)化的 EDV/AAV 雙載體系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)定點(diǎn)的 CAR-T 細(xì)胞生成，從而在體內(nèi)原位重編程 T 細(xì)胞，以對(duì)多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤模型產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞治療反應(yīng)，這確立了體內(nèi) TRAC-CAR-T 細(xì)胞生成是一種極具前景的細(xì)胞治療平臺(tái)。

意義與展望
這項(xiàng)研究首次實(shí)現(xiàn)了在體內(nèi)對(duì)原代人類 T 細(xì)胞進(jìn)行大片段 DNA 的靶向定點(diǎn)整合，標(biāo)志著 in vivo CAR-T 技術(shù)邁向了更精準(zhǔn)、更可控的新時(shí)代，其潛在優(yōu)勢包括——

• 降低成本與時(shí)間：省去復(fù)雜的分離、體外擴(kuò)增和制造流程；
• 提升可及性：有望成為“現(xiàn)貨型”療法，惠及更廣泛的患者；
• 增強(qiáng)安全性：精準(zhǔn)的 T 細(xì)胞特異性編輯，降低潛在脫靶風(fēng)險(xiǎn)。

總的來說，該研究展示了在活體中的特定位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性插入大片段 DNA 的新技術(shù)。至關(guān)重要的是，該研究克服了在患者體內(nèi)生成 CAR-T 細(xì)胞用于治療應(yīng)用所面臨的主要障礙，這對(duì)于開發(fā)無需細(xì)胞分離和制造的細(xì)胞療法具有重要意義。研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，這一進(jìn)展將對(duì)細(xì)胞療法試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和實(shí)施產(chǎn)生重大影響，并改善患者獲得前沿 CAR-T 細(xì)胞治療的機(jī)會(huì)。