在分子生物學(xué)實驗室里，RNA表達(dá)分析堪稱“基礎(chǔ)中的基礎(chǔ)”，從基因功能驗證到疾病標(biāo)志物篩選，幾乎都離不開它的身影。但不少科研人都曾踩過坑：提的RNA降解嚴(yán)重、逆轉(zhuǎn)錄效率忽高忽低、熒光定量結(jié)果重復(fù)性差……其實，搞定這些問題的關(guān)鍵，就藏在TriiZol裂解提取、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA、熒光定量PCR（qPCR）檢測這“三件套”里。今天就帶大家吃透這套黃金組合的操作精髓，讓你的RNA表達(dá)研究一路綠燈！

第一關(guān)：TriiZol法提取RNA——守住實驗的“源頭活水”
RNA天生“嬌弱”，易被核酸酶降解，而TriiZol試劑憑借強大的裂解能力和核酸酶抑制效果，成為提取總RNA的“王牌選手”。無論是動物組織、植物樣本還是細(xì)胞，它都能輕松應(yīng)對，幫你拿到高質(zhì)量RNA。

TriiZol（abs60154）標(biāo)準(zhǔn)操作PROTOCOL

1. 樣本處理
組織樣本：
TriiZol用量：每 50-100 mg 組織加 1 ml TriiZol，樣品體積不應(yīng)超過TriiZol體積的10％。
（1）將動物或植物組織切成小塊，在液氮中磨碎或用勻漿器勻漿處理。
（2）將研磨好的組織粉末快速轉(zhuǎn)入裝有1 ml TriiZol 的 2 ml 離心管中，在渦旋振蕩器上迅速振蕩混勻，置于冰上，待所有的樣品研磨完。
（3）裂解產(chǎn)物應(yīng)呈澄清的透明粘稠液體。對于富含蛋白、脂肪或多糖物質(zhì)的組織樣品如肌肉、脂肪組織和植物結(jié)節(jié)部位等，勻漿后仍會存留有不溶物質(zhì)，可于 4℃ 12,000 x g 離心 10 min，然后吸取上清至一新的離心管中。

細(xì)胞樣本：
（1）貼壁細(xì)胞：吸盡培養(yǎng)液，每 10 cm²培養(yǎng)面積（6 孔板單孔或 35 mm 平皿）加入 1 ml TriiZol，用加樣器吹打數(shù)次，以確保細(xì)胞完全裂解，然后轉(zhuǎn)移至離心管中。
注：TriiZol 的使用量應(yīng)由培養(yǎng)皿表面積決定，而非由細(xì)胞數(shù)目決定。TriiZol量不足可能導(dǎo)致提取的RNA中有DNA污染 。
（2）懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，每5-10×10⁶動植物或酵母細(xì)胞，或每1×10⁷細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TriiZol，用加樣器吹打，使其完全裂解，然后轉(zhuǎn)移至離心管中。
 注：添加 TriiZol 前切勿洗滌細(xì)胞，以免 RNA 降解。必要時可以用勻漿器來裂解某些細(xì)菌或者酵母細(xì)胞。

2．液相分離
（1）裂解產(chǎn)物于室溫放置5 min，使核酸-蛋白復(fù)合物完全分離。（注：此時樣品可在-80℃長期保存。）
（2）每 1 ml TriiZol 加入 0.2 ml 氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩 15 s，室溫放置 2-3 min。
（3）4℃ 12,000 × g 離心 15 min，樣品會分成三層：桔黃色的下層有機相(蛋白)，中間層（DNA）和無色的上層水相。
（4）吸取含總RNA 的上層水相至一新的離心管中，吸取水相的體積為所用TriiZol試劑的 60％。
注：轉(zhuǎn)移水相時切勿觸及中間層，否則可能導(dǎo)致基因組DNA污染

3． RNA 回收
（1）按照每 1 ml TriiZol 的最初使用量加入0.5 mL 異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，室溫放置10 min。
（2）4℃ 12,000 × g 離心 10 min，棄除上清，可見膠狀的RNA沉淀。
（3）按照每 1 ml TriiZol 的最初使用量加入1 ml 75%乙醇，顛倒數(shù)次混勻，洗滌沉淀。
（4）4℃ 12,000 × g 離心 5 min，棄除上清。
（5）室溫倒置5-10 min 晾干或真空抽干（不要使用真空干燥離心機，以免RNA過干，難以溶解）。
（6）加入適量（如 25ul）DEPC-ddH₂O 或TE緩沖液，用加樣器吹打數(shù)次溶解 RNA。
（7）通過 RNA 電泳以及紫外分光光度計檢測，確定 RNA 的濃度、純度和完整性。
（8）所得的 RNA 應(yīng)立即使用或適量分裝后-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

注意事項：
1、如果需要測量 RNA 的 A260/A280 的比值，建議使用RNA定量緩沖液對樣品稀釋后，進(jìn)行測量。
2、所有離心管，槍頭及相關(guān)溶液都必須無 RNA酶污染。耐高溫器物可 180℃烘烤 4 小時以去除RNA 酶，其它器物去除 RNA 酶可考慮用 0.01%的 DEPC 水浸泡過夜，然后滅菌，烘干。溶液需用 DEPC 水配制。加 0.01% DEPC 至重蒸水或 MiliQ 級水中，處理過夜，滅菌即成 DEPC 水。
3、使用凍存的細(xì)胞或組織抽提總 RNA 的效果通常比新鮮的細(xì)胞或組織差一些。因為在細(xì)胞或組織凍融過程中一些細(xì)胞或組織內(nèi)的 RNase 會被釋放出來并剪切樣品。如果不能及時抽 RNA， 推薦先加入適量 TriiZol，并裂解樣品后凍存。
4、必須戴一次性手套操作，且盡量不要對著 RNA 樣品呼氣或說話，以防 RNA 酶污染。建議戴一次性口罩操作。
5、TriiZol 含有毒物質(zhì)苯酚，避免接觸皮膚或吸入。為防止濺入眼睛，請戴防護(hù)眼鏡或使用透明保護(hù)屏。如皮膚接觸 TriiZol，請立即用大量去垢劑和水沖洗，如仍有不適，請聽取醫(yī)生意見。
6、為了您的自身安全，使用試劑前，請做好防護(hù)，如穿實驗服，帶手套等。

產(chǎn)品信息

第二關(guān)：逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA——搭建RNA到qPCR的“橋梁”
RNA無法直接用于PCR擴增，逆轉(zhuǎn)錄過程就是將RNA模板合成為穩(wěn)定的cDNA，這一步的效率直接決定了后續(xù)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。選擇合適的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，并嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，是成功的關(guān)鍵。

逆轉(zhuǎn)錄一管化三代預(yù)混液(abs60246)標(biāo)準(zhǔn)操作PROTOCOL

1． 冰上配制如下反應(yīng)體系： 

a. 推薦使用已去除基因組DNA污染的高質(zhì)量RNA作為模板。
2.輕柔吸打混勻，瞬離；
3.55℃溫育 15 min；注：若目標(biāo) RNA 不含 Poly(A) 結(jié)構(gòu)，可預(yù)先 25℃溫育 10 min。
4. 反應(yīng)結(jié)束后，85℃溫育 5 min 以終止反應(yīng)；
5. 將獲得的 cDNA 溶液置于冰上，用于后續(xù)實驗；或立即保存于-20℃。

注意事項：
預(yù)混液中已經(jīng)包含 Oligo(dT)20VN 和隨機引物，不僅適用于包含Poly(A) 結(jié)構(gòu)的真核生物mRNA，也適用于不含Poly(A) 結(jié)構(gòu)的原核生物 RNA、真核生物rRNA 和 tRNA等模板，但不適用于miRNA 等小RNA模板。

產(chǎn)品信息

同時也推薦使用First-strand cDNA Synthesis Mix With gDNA Remover(abs601510), cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑（含去基因組），產(chǎn)品鏈接：https://www.absin.cn/1-cdna/abs601510.html?mk_channel=SWQCasbin

第三關(guān)：熒光定量PCR——精準(zhǔn)量化的“終極武器”
熒光定量PCR通過實時檢測擴增過程中的熒光信號，實現(xiàn)對cDNA的定量分析，是評估基因表達(dá)水平的金標(biāo)準(zhǔn)。要獲得可靠結(jié)果，需兼顧體系配制、程序設(shè)置和結(jié)果分析三大要點。

SYBR Advanced qPCR SuperMix Kit(abs60087)標(biāo)準(zhǔn)操作PROTOCOL

一、實驗須知：
1. SYBR Advanced qPCR SuperMix Kit是針對兩步法反應(yīng)開發(fā)，變性步驟在95℃下進(jìn)行，退火/延伸綜合步驟在60℃下進(jìn)行，同樣適用于Tm低于60℃的引物；
2. 為確保采用SYBR Green進(jìn)行Real-Time PCR時具有最高效率，產(chǎn)物長度建議為60-200bp；
3. PCR反應(yīng)時必須先進(jìn)行熱啟動步驟，即在95℃下孵育2min，激活熱啟動DNA Polymerase；
4. 對于96孔模塊PCR儀，建議的反應(yīng)物終體積為20µL。對384孔模塊PCR儀，建議的反應(yīng)物終體積為10µL。

二、操作步驟：
1. 將2×SYBR Advanced qPCR SuperMix、模板gDNA或cDNA、引物、ROX Reference Dye（根據(jù)需要）以及RNase-Free Water解凍并混勻，根據(jù)下表制備反應(yīng)混合液。由于存在熱啟動機制，構(gòu)建反應(yīng)或設(shè)置實時定量PCR儀時，無需將樣品一直放置在冰上。

2. 充分混勻反應(yīng)混合物，并取適當(dāng)體積加入PCR管或反應(yīng)板中。
3. 將模板gDNA或cDNA（≤100ng/次）加入含有反應(yīng)混合液的各個PCR管或孔中。對于兩步法RT-PCR，加入的cDNA（未稀釋的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物）體積不能超過PCR終體積的10%。
4. 根據(jù)下表中列出的程序設(shè)置實時定量PCR儀。應(yīng)在進(jìn)行退火 / 延伸步驟時收集數(shù)據(jù)。

*注意：
1、熔解曲線分析是實時定量 PCR 儀軟件內(nèi)置的一項分析步驟。進(jìn)行此分析時，須遵守儀器提供的說明。
2、如果 PCR 儀無法在這么短的時間內(nèi)完成數(shù)據(jù)采集，則以儀器采集數(shù)據(jù)所需的最短時為準(zhǔn)。
3、該溫度也同樣適用于所有Tm低于60℃的引物。
4、循環(huán)數(shù)取決于模板DNA的量。
5、將 PCR 管或反應(yīng)板放置在實時定量PCR儀上并啟動PCR程序。
6、對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。

此項分析功能已內(nèi)置于實時定量 PCR 儀的軟件中，我們強烈建議您定期進(jìn)行此項分析以驗證 PCR 產(chǎn)物的特異性。

技術(shù)指標(biāo)：
ROX Reference Dye可加入到2×SYBR Advanced qPCR SuperMix中以便長期儲存。

高ROX Reference Dye機型：ABI Prism7000/7300/7700/7900HT/ 7900HT Fast和ABI Step One /ABI StepOne Plus等；

低ROX Reference Dye機型：ABI Prism7500/7500 Fast/ViiA7/ QuantStudio 3/5/6 /7, Stratagene MX4000/MX3005P/MX3000P系列，MJ Research Chromo4，Opticon (II) ，Corbett Rotor Gene 3000等；

無需加ROX Reference Dye機型：Thermal Cycler Dice Real Time System，Corbett Rotor-gene6000，Bio-Rad CFX系列，Roche LightCycler® 480，Qiagen Rotor-Gene Q，Analytik Jena qTOWER系列等。

產(chǎn)品信息

RNA表達(dá)研究的成功，離不開三件套的環(huán)環(huán)相扣：TriiZol提取的高質(zhì)量RNA是基礎(chǔ)，逆轉(zhuǎn)錄的高效轉(zhuǎn)化是橋梁，熒光定量的精準(zhǔn)擴增是核心。掌握了這套TriiZol +逆轉(zhuǎn)錄+熒光定量的操作指南和注意事項，你就能輕松應(yīng)對RNA表達(dá)分析中的各種難題。一套靠譜的試劑組合+規(guī)范的操作流程，就是你科研路上的“神隊友”，幫你高效獲得可靠數(shù)據(jù)，加速科研成果落地！