在病理制片的整個(gè)流程中，固定是最關(guān)鍵的一步，也是最無法補(bǔ)救的一步。一旦組織自溶或腐敗，任何后續(xù)操作都無法逆轉(zhuǎn)。

所謂固定，就是組織離體后，通過各種方法使其細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)盡可能接近生活狀態(tài)時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置。

固定的核心目的是防止組織、細(xì)胞自溶與腐敗，抑制細(xì)胞內(nèi)酶對(duì)蛋白質(zhì)的分解作用，使細(xì)胞內(nèi)的各種成分——蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、酶類等——轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持原有的結(jié)構(gòu)與生活時(shí)相仿。

此外，固定還能使組織硬化，增加韌性，為后續(xù)的取材和脫水創(chuàng)造良好條件。

固定的八大注意事項(xiàng)

一、固定必須及時(shí)
組織離體后，必須在1小時(shí)內(nèi)立即固定。時(shí)間延誤，自溶開始，不可逆轉(zhuǎn)。

二、固定液的選擇
應(yīng)根據(jù)制作要求選擇合適的固定液。最常用的是4%甲醛液或4%中性緩沖甲醛液。

三、固定液的量
固定液體積必須大于組織體積的4至10倍。量不足，固定不。

四、固定液的濃度
濃度必須準(zhǔn)確。過稀或過濃都會(huì)影響組織形態(tài)和固定效果。

五、固定液的質(zhì)量
發(fā)現(xiàn)固定液變質(zhì)——如甲醛液體產(chǎn)生白色沉淀——應(yīng)立即更換，不可將就。

六、固定的溫度
室溫或35-37℃的全封閉組織處理機(jī)內(nèi)均可。溫度過高會(huì)加速組織自溶和過度收縮，并破壞細(xì)胞內(nèi)抗原和DNA。

七、固定的時(shí)間
新鮮標(biāo)本應(yīng)剖開固定12-24小時(shí)后再取材。取材后，大標(biāo)本需再固定4-6小時(shí)，小標(biāo)本需再固定3-4小時(shí)。

新鮮小標(biāo)本取材后，應(yīng)再固定4-8小時(shí)。室溫低時(shí)，固定時(shí)間需延長(zhǎng)�？偣潭〞r(shí)間不宜超過48小時(shí)。

八、分子病理的特殊要求
需要做分子病理的標(biāo)本，從離體至脫水開始，總固定時(shí)間一般控制在6至24小時(shí)之間（組織厚度2mm）。

少于6小時(shí)固定不充分，超過24小時(shí)可能影響檢測(cè)結(jié)果。

最常用的固定液

4%甲醛液（10%福爾馬林液）

甲醛是一種無色易溶的刺激性氣體。市售甲醛水溶液實(shí)際濃度為40%，易揮發(fā)，日久會(huì)自行分解產(chǎn)生白色沉淀（副醛：多聚甲醛或三聚甲醛），并有甲酸生成，影響組織固定和細(xì)胞核染色。長(zhǎng)期保存應(yīng)加入碳酸鎂、碳酸鈣等碳酸鹽中和。

病理標(biāo)本固定常用的4%甲醛水溶液（9份水加1份濃甲醛液，實(shí)際含甲醛4%，俗稱10%福爾馬林液），通過使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用。

其組織穿透性好，組織收縮小，HE染色對(duì)比鮮明，能完好保存組織形態(tài)。但交聯(lián)和共價(jià)鍵的形成改變了蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)并覆蓋抗原決定簇，會(huì)降低組織抗原性。

因此，目前國(guó)際上都提倡使用10%中性緩沖福爾馬林液。

4%甲醛液的優(yōu)點(diǎn)：滲透能力較強(qiáng)，固定均勻；組織收縮��；能保存脂肪和類脂體（適用于冰凍切片）；增加組織韌性；有利于嗜銀染色；可固定高爾基體和線粒體。

4%甲醛液的缺點(diǎn)：不能沉淀核蛋白和白蛋白；溶解組織內(nèi)尿酸鹽結(jié)晶；經(jīng)甲醛固定的陳舊組織容易產(chǎn)生色素沉淀（可用堿性乙醇去除：濃氨水1ml加入75%乙醇200ml，切片脫蠟后浸入30分鐘；或1%氫氧化鉀1ml加入80%乙醇100ml，切片脫蠟后浸入10分鐘。如未去除干凈可延長(zhǎng)時(shí)間，處理后流水沖洗5分鐘，常規(guī)染色）。

4%中性緩沖甲醛液（10%中性緩沖福爾馬林液）

這種固定液能完好保存組織形態(tài)，使蛋白質(zhì)、核酸等大分子在細(xì)胞內(nèi)原位凝固沉淀，防止崩解和彌漫流失，對(duì)大多數(shù)抗原和腫瘤基因保存較好，是免疫組織化學(xué)和分子病理最常用的固定液。固定時(shí)間以24-36小時(shí)為宜。

配方：甲醛100ml，蒸餾水900ml，磷酸二氫鈉（NaH₂PO₄·H₂O）4g，磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄）6.5g，用1N NaOH調(diào)整pH至7.0。由于國(guó)內(nèi)甲醛質(zhì)量不穩(wěn)定，實(shí)際應(yīng)用中取甲醛120ml，蒸餾水880ml，磷酸二氫鈉4g，磷酸氫二鈉13g，效果更好。

關(guān)于固定液的選擇：10%福爾馬林液是最常用的病理標(biāo)本固定液。隨著免疫組化和分子病理的普及，提倡使用10%中性緩沖福爾馬林液，以更好地保存抗原及腫瘤基因。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)顯示，雖然多數(shù)抗原保存差異不明顯，但對(duì)少數(shù)組織的抗原和FISH癌基因檢測(cè)（如Her-2）影響較為明顯。固定時(shí)間結(jié)束后，如遇周末休息，應(yīng)將組織長(zhǎng)時(shí)間停留在75%乙醇或95%酒精中。

關(guān)于細(xì)胞核染色：HE染色細(xì)胞核的等電點(diǎn)pH為3.3-3.6。經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林液固定后，在一定程度上改變了細(xì)胞核的pH值，影響細(xì)胞核與蘇木精染料的結(jié)合，特別是固定不充分時(shí)，細(xì)胞核容易發(fā)灰。

關(guān)于固定與脫水的關(guān)系：固定不佳的組織，由于脫水劑（乙醇）能使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固，導(dǎo)致脫水劑難以滲入組織內(nèi)部，造成脫水不佳；同時(shí)乙醇又起到凝固性固定的作用，使交聯(lián)與凝固性固定混合，對(duì)抗原保存產(chǎn)生不良影響。固定充分的組織，由于固定液已全部滲透到組織內(nèi)部并與組織結(jié)合，脫水劑很容易將固定液和水分置換出來，脫水順暢。固定不足對(duì)抗原的影響，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過固定過度造成的影響。

關(guān)于固定時(shí)間、濃度與滲透速度：手術(shù)切除的器官及腫瘤標(biāo)本，由于具有一定的立體外形和包膜，固定液濃度過高會(huì)引起周圍組織收縮，影響液體滲透至深處，造成中央固定不佳；濃度過低則容易造成邊緣水腫、中央固定不佳。大標(biāo)本如脾、腎、全胃、腸等臟器，10%福爾馬林液24小時(shí)只能穿透2-3mm的實(shí)體組織和5mm的多孔疏松組織（滲透速度受標(biāo)本致密度、包膜厚度、脂肪包裹、固定液量、溫度等因素影響）。取材后的組織，兩面被刀切過，固定液容易滲透。如標(biāo)本厚度超過5mm，經(jīng)24小時(shí)固定后，通常只有邊緣1-2mm的組織固定好，中央部分固定不佳甚至腐爛。因此，大標(biāo)本應(yīng)剖開固定，厚度以3-5mm為佳。

取材后的標(biāo)本，脫水前還應(yīng)再固定6-8小時(shí)。

在一定范圍內(nèi)，固定液濃度越高，所需固定時(shí)間越短（但濃度過高會(huì)使組織發(fā)硬、細(xì)胞收縮明顯）；濃度越低，所需時(shí)間越長(zhǎng)（濃度過低會(huì)導(dǎo)致組織水腫，甚至變質(zhì)）。因此，選擇合適的固定液濃度，不僅能快速固定組織，還能保存優(yōu)良的細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和抗原。

關(guān)于固定速度與溫度的關(guān)系：固定液溫度越高，固定速度越快，所需時(shí)間越短，但細(xì)胞收縮也越明顯，抗原丟失越多，過高的溫度還會(huì)加速組織腐爛（固定液尚未滲透到的部分因溫度升高而變質(zhì)）。溫度越低，固定速度越慢，過慢同樣會(huì)使未滲透到的組織變性。因此，選擇合適的組織厚度和固定溫度非常重要。大標(biāo)本應(yīng)剖開后在室溫下固定，取材后的標(biāo)本可選擇室溫18-25℃固定。室溫下降時(shí)，應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)固定時(shí)間，在37-45℃恒溫箱或全自動(dòng)恒溫密封式脫水機(jī)內(nèi)固定。

乙醇（CH₃CH₂OH）：易燃、易揮發(fā)，還原劑，能被氧化成乙醛，不能與鉻酸、重鉻酸鉀等氧化劑配成固定液。優(yōu)點(diǎn)是有固定、硬化和脫水作用，保存糖原可用100%乙醇固定，保存漿膜抗原優(yōu)于10%中性福爾馬林。缺點(diǎn)是滲透力較弱，易造成表面發(fā)硬；能沉淀核蛋白但沉淀物溶于水，導(dǎo)致核著色不良；可溶解血紅蛋白，損害多種色素；固定速度較慢；對(duì)某些抗原有損傷，對(duì)核抗原保存不利；易引起組織細(xì)胞收縮。95%乙醇常用于細(xì)胞涂片固定，組織標(biāo)本固定一般不采用，只有在無福爾馬林時(shí)臨時(shí)使用，待送達(dá)有福爾馬林的科室后應(yīng)立即更換。目前許多環(huán)保固定液均為醇性固定液。

乙酸（冰醋酸）：在氣溫16.6℃以下會(huì)結(jié)成冰狀固體，故稱冰醋酸。乙酸能沉淀核蛋白，使未分裂細(xì)胞核的染色質(zhì)沉淀成塊狀，可清晰顯示細(xì)胞核結(jié)構(gòu)。滲透性強(qiáng)、固定快，能使組織膨脹，與其他液體配合使用，如甲醛乙酸液（10ml甲醛，5ml乙酸，85ml水）對(duì)HE切片固定效果好，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，染色對(duì)比鮮明。但乙酸不能沉淀白蛋白，也不能固定脂肪、糖和類脂。

苦味酸（2,4,6-三硝基苯酚）：黃色晶體，常制成飽和溶液貯藏。能沉淀蛋白質(zhì)，具有軟化組織和脫鈣作用，常與其他液體配合使用，如Bouin液（飽和苦味酸水溶液75ml，甲醛20ml，乙酸5ml）。Bouin液是骨髓、睪丸等組織固定的良好固定液，適用于結(jié)締組織染色，尤其是三色染色。由于pH約1.7，對(duì)抗原有損害，不適宜長(zhǎng)期保存，固定時(shí)間12-24小時(shí)。經(jīng)苦味酸或Bouin液固定的組織必須流水沖洗4小時(shí)以上。

B-5固定液（乙酸鈉--甲醛固定液）：滲透力較強(qiáng)，多用于固定淋巴組織。配方：無水乙酸鈉1.25g，6g，甲醛10ml（用時(shí)加入），蒸餾水90ml。不加甲醛即為B-4固定液。用含汞成分固定的組織，染色前必須先用0.5%碘酒（70%乙醇加入碘）脫汞處理。

重鉻酸鉀（K₂Cr₂O₇）：橙紅色板狀結(jié)晶，有毒性。常用1%-3%水溶液作固定，穿透力極強(qiáng)，組織收縮��；可使蛋白質(zhì)變?yōu)椴蝗苄缘�不能使其沉淀（加入乙酸后可使蛋白質(zhì)沉淀）；對(duì)線粒體、高爾基氏體固定效果較好。缺點(diǎn)是可溶解染色質(zhì)。經(jīng)重鉻酸鉀固定的組織必須流水沖洗12小時(shí)以上。

戊二醛（C₅H₈O₂）：無色透明油狀液體，有刺激性氣味。對(duì)糖蛋白、糖原、微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞基質(zhì)等固定作用較好，穿透力強(qiáng)于，能保存某些酶活力，長(zhǎng)時(shí)間固定不會(huì)使組織變脆。但不能保存脂肪，對(duì)細(xì)胞膜顯示較差，也無電子染色作用。常用2.5%水溶液作電鏡組織處理的前固定，固定時(shí)間2小時(shí)以上。

（OsO₄）：白色或淡黃色晶體，劇毒，強(qiáng)氧化劑。對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪、脂蛋白固定良好，有較強(qiáng)的電子染色作用，圖像反差好。常用1%水溶液作電鏡組織處理的后固定，固定時(shí)間視溫度而定：室溫高于18-20℃時(shí)1小時(shí)，低于18-20℃時(shí)1.5-2小時(shí)。缺點(diǎn)：固定時(shí)間過長(zhǎng)易使組織發(fā)脆，不易切片；需臨用前幾天配制以確保充分溶解。

Carnoy液：對(duì)染色體固定較好，能很好顯示DNA和RNA。固定速度快，3mm厚組織塊固定1小時(shí)左右，較厚組織不超過4小時(shí)。配方：乙酸10ml，30ml，無水乙醇60ml。

Helly液（Zenker福爾馬林液）：對(duì)細(xì)胞質(zhì)固定較好，特別是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)特殊顆粒、胰島以及心肌閏盤保存效果良好。因含汞成分，染色前需用0.5%碘酒脫汞處理。配方：重鉻酸鉀2.5g，5g，蒸餾水100ml，甲醛5ml。

Kanovsky液：對(duì)細(xì)胞抗原、微細(xì)結(jié)構(gòu)的保存優(yōu)于單純戊二醛，常用于免疫電鏡標(biāo)本的前固定。先灌注、再浸泡，固定時(shí)間10-30分鐘，緩沖液漂洗后用蔗糖液浸泡，恒溫冷凍切片。配方：25%戊二醛10ml，40%甲醛5ml，0.2mol/L二甲胂酸鈉緩沖液49ml，無水氯化鈣50mg，蒸餾水33.5ml（加入），pH7.3。

Rossman液：常用于糖原固定。組織固定12-24小時(shí)后，用95%乙醇洗，無水乙醇脫水。配方：無水乙醇苦味酸飽和液90ml，甲醛10ml。

Zenker液：對(duì)免疫球蛋白、病毒包涵體（如Negri小體）固定效果較好，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色清晰，常用于三色、磷鎢酸-蘇木精等特殊染色。不適合含血量較多的標(biāo)本。固定時(shí)間12-36小時(shí)，加熱可加快固定。配方：儲(chǔ)存液由重鉻酸鉀2.5g，5g，蒸餾水100ml組成，用時(shí)加入乙酸5ml。配制時(shí)加溫至40-50℃溶解，冷卻后過濾，保存于棕色玻璃磨砂瓶?jī)?nèi)。此液不能用金屬容器盛放，組織固定后也不能用金屬鑷子夾取。用Zenker液固定的組織必須流水沖洗12小時(shí)去除重鉻酸鉀，脫水前用0.5%碘酒脫汞處理。

4%多聚甲醛液：常用于免疫組織化學(xué)組織固定。配方：4g多聚甲醛溶于100ml蒸餾水，加溫至60℃攪拌溶解。多聚甲醛不易溶解，也可將液體放入密封瓶中，60℃溫箱過夜溶解。

固定，是整個(gè)制片流程中無法回頭的一步。這一步做扎實(shí)了，后續(xù)的脫水、切片、染色才有意義。這一步馬虎了，后面再怎么補(bǔ)救，都很難得到一張真正合格的切片。