PfAgo核酸內(nèi)切酶的工作原理、應(yīng)用及常見問(wèn)題解答
一、PfAgo 核酸內(nèi)切酶是什么？
PfAgo 全稱為Pyrococcus furiosus Argonaute，是來(lái)源于激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）的熱穩(wěn)定核酸內(nèi)切酶，屬于 Argonaute（Ago）蛋白家族。該酶通過(guò)基因工程技術(shù)在重組大腸桿菌中表達(dá)純化，是分子生物學(xué)研究、核酸檢測(cè)領(lǐng)域的重要工具酶。
二、PfAgo 核酸內(nèi)切酶的工作原理
PfAgo 的核心功能依賴引導(dǎo) DNA（guide DNA）與靶核酸的堿基互補(bǔ)配對(duì)：
1，引導(dǎo) DNA 與靶核酸（以單鏈 DNA 為主，對(duì)單鏈 RNA 也有一定活性）發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，形成特異性結(jié)合；
2，PfAgo 激活核酸內(nèi)切酶活性，對(duì)靶核酸進(jìn)行特異性剪切；
3，剪切過(guò)程不受靶標(biāo)序列、剪切位點(diǎn)相鄰序列的限制，可靈活設(shè)計(jì)引導(dǎo)序列。
此外，PfAgo 具有極強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，95℃孵育 1 小時(shí)后酶活性無(wú)損失，適配高溫反應(yīng)體系。同時(shí)，PfAgo 剪切靶標(biāo)核酸產(chǎn)生的產(chǎn)物，可作為新生的次級(jí)引導(dǎo) DNA，為高靈敏度核酸檢測(cè)技術(shù)提供基礎(chǔ)。
PfAgo 核酸內(nèi)切酶體外切割活性驗(yàn)證電泳圖
下圖為 PfAgo 核酸內(nèi)切酶的體外切割實(shí)驗(yàn)結(jié)果，直觀驗(yàn)證其剪切活性：
M：核酸 Marker，標(biāo)注了 16 nt、25 nt、35 nt、50 nt、60 nt 的核酸條帶，用于判斷核酸片段長(zhǎng)度；
Control 組：未添加 PfAgo，僅存在 60 nt 的靶標(biāo) DNA（Target）條帶，無(wú)剪切產(chǎn)物；
PfAgo 組：添加 PfAgo 后，60 nt 靶標(biāo) DNA 被有效剪切，產(chǎn)生 35 nt、25 nt 的剪切產(chǎn)物（product），同時(shí)保留 16 nt 的引導(dǎo) DNA（guide），證明 PfAgo 的高效特異性剪切活性。
三、PfAgo 核酸內(nèi)切酶常見問(wèn)題解答（FAQ）
Q1：pfAgo 核酸內(nèi)切酶和 Ago 核酸內(nèi)切酶（微球）有哪些差別？
A：兩者狀態(tài)不一樣、保存條件不一樣；檢測(cè)方法、使用的效果幾乎一樣。
Q2：pfAgo 核酸內(nèi)切酶 buffer 是否含有金屬離子？
A：Buffer 中不含金屬離子，對(duì)于擴(kuò)增反應(yīng)沒有任何影響。一般 PfAgo 酶可以兼容絕大多數(shù) PCR buffer，但普通 Taq 酶不兼容 PfAgo buffer。
Q3：限制性內(nèi)切酶無(wú)法切割 DNA 有哪些原因？
A：
1）內(nèi)切酶失活：用標(biāo)準(zhǔn)底物檢測(cè)酶活性；
2）DNA 不純，含有 SDS、酚、EDTA 等內(nèi)切酶抑制因子：將 DNA 過(guò)柱純化，乙醇沉淀 DNA；
3）條件不適（試劑、溫度）：檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳；
4）DNA 不存在該酶識(shí)別序列：換用其它的酶切割 DNA 或過(guò)量酶消化驗(yàn)證。
PfAgo 全稱為Pyrococcus furiosus Argonaute，是來(lái)源于激烈火球菌（Pyrococcus furiosus）的熱穩(wěn)定核酸內(nèi)切酶，屬于 Argonaute（Ago）蛋白家族。該酶通過(guò)基因工程技術(shù)在重組大腸桿菌中表達(dá)純化，是分子生物學(xué)研究、核酸檢測(cè)領(lǐng)域的重要工具酶。
二、PfAgo 核酸內(nèi)切酶的工作原理
PfAgo 的核心功能依賴引導(dǎo) DNA（guide DNA）與靶核酸的堿基互補(bǔ)配對(duì)：
1，引導(dǎo) DNA 與靶核酸（以單鏈 DNA 為主，對(duì)單鏈 RNA 也有一定活性）發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，形成特異性結(jié)合；
2，PfAgo 激活核酸內(nèi)切酶活性，對(duì)靶核酸進(jìn)行特異性剪切；
3，剪切過(guò)程不受靶標(biāo)序列、剪切位點(diǎn)相鄰序列的限制，可靈活設(shè)計(jì)引導(dǎo)序列。
此外，PfAgo 具有極強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，95℃孵育 1 小時(shí)后酶活性無(wú)損失，適配高溫反應(yīng)體系。同時(shí)，PfAgo 剪切靶標(biāo)核酸產(chǎn)生的產(chǎn)物，可作為新生的次級(jí)引導(dǎo) DNA，為高靈敏度核酸檢測(cè)技術(shù)提供基礎(chǔ)。
PfAgo 核酸內(nèi)切酶體外切割活性驗(yàn)證電泳圖
下圖為 PfAgo 核酸內(nèi)切酶的體外切割實(shí)驗(yàn)結(jié)果，直觀驗(yàn)證其剪切活性：
M：核酸 Marker，標(biāo)注了 16 nt、25 nt、35 nt、50 nt、60 nt 的核酸條帶，用于判斷核酸片段長(zhǎng)度；
Control 組：未添加 PfAgo，僅存在 60 nt 的靶標(biāo) DNA（Target）條帶，無(wú)剪切產(chǎn)物；
PfAgo 組：添加 PfAgo 后，60 nt 靶標(biāo) DNA 被有效剪切，產(chǎn)生 35 nt、25 nt 的剪切產(chǎn)物（product），同時(shí)保留 16 nt 的引導(dǎo) DNA（guide），證明 PfAgo 的高效特異性剪切活性。
三、PfAgo 核酸內(nèi)切酶常見問(wèn)題解答（FAQ）
Q1：pfAgo 核酸內(nèi)切酶和 Ago 核酸內(nèi)切酶（微球）有哪些差別？
A：兩者狀態(tài)不一樣、保存條件不一樣；檢測(cè)方法、使用的效果幾乎一樣。
Q2：pfAgo 核酸內(nèi)切酶 buffer 是否含有金屬離子？
A：Buffer 中不含金屬離子，對(duì)于擴(kuò)增反應(yīng)沒有任何影響。一般 PfAgo 酶可以兼容絕大多數(shù) PCR buffer，但普通 Taq 酶不兼容 PfAgo buffer。
Q3：限制性內(nèi)切酶無(wú)法切割 DNA 有哪些原因？
A：
1）內(nèi)切酶失活：用標(biāo)準(zhǔn)底物檢測(cè)酶活性；
2）DNA 不純，含有 SDS、酚、EDTA 等內(nèi)切酶抑制因子：將 DNA 過(guò)柱純化，乙醇沉淀 DNA；
3）條件不適（試劑、溫度）：檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳；
4）DNA 不存在該酶識(shí)別序列：換用其它的酶切割 DNA 或過(guò)量酶消化驗(yàn)證。
| 名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
| PfAgo核酸內(nèi)切酶（RADAR用微球) | abs60370-50T | 50T |
| PfAgo核酸內(nèi)切酶 | abs60340-200uL | 200uL |
| PfAgo核酸內(nèi)切酶 | abs60340-200uL | 200uL |
標(biāo)簽：
PfAgo
核酸內(nèi)切酶
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