【Cell】揭秘如何精準(zhǔn)開發(fā)激酶激活劑，為心臟疾病帶來新曙光

研究背景：
在藥物研發(fā)領(lǐng)域，激酶抑制劑早已是癌癥治療的核心手段。然而，在心血管疾病、代謝性疾病的治療中，往往需要增強(qiáng)特定的保護(hù)性信號(hào)通路（如PAK1、AMPK）， 但科學(xué)家們卻長(zhǎng)期面臨一個(gè)困境：如何開發(fā)激酶激活劑？

近日，由牛津大學(xué)雷鳴教授團(tuán)隊(duì)主導(dǎo)，聯(lián)合來自中國(guó)及歐洲多國(guó)的研究團(tuán)隊(duì)共同在頂級(jí)期刊《Cell》上發(fā)表了一項(xiàng)突破性研究，首次報(bào)道了一種小分子PAK1變構(gòu)激活劑。文章不僅揭示了PAK1的“自身抑制釋放”機(jī)制，還在肥厚型心肌病模型中證實(shí)了顯著的治療效果。更重要的是，提出了一種可推廣的肽引導(dǎo)激酶激活劑發(fā)現(xiàn)策略。

為何激活比抑制更難？

1. 激酶激活劑：一個(gè)未被滿足的臨床需求
在人體內(nèi)，激酶是信號(hào)通路的“開關(guān)”。抑制劑通過“關(guān)掉”異常活躍的激酶來治療癌癥，但很多疾病（如心力衰竭、糖尿病）恰恰需要“打開”特定的保護(hù)性激酶。然而，開發(fā)激酶激活劑遠(yuǎn)比抑制劑困難—因?yàn)樗�需要精�?zhǔn)地理解激酶自身的“制動(dòng)”機(jī)制。

2. PAK1：心臟保護(hù)的“守門員”
PAK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在心臟中扮演著至關(guān)重要的保護(hù)角色。以往研究表明，增強(qiáng)PAK1活性可以對(duì)抗病理性心肌肥厚、心力衰竭和心律失常。然而，此前從未有過直接、選擇性的小分子PAK1激活劑問世。

3. 研究的突破口：自身抑制結(jié)構(gòu)域
PAK1在靜息狀態(tài)下處于“自身抑制”狀態(tài)——它的一個(gè)激酶抑制片段（類似于“安全插銷”）會(huì)插入自身活性口袋，堵住底物和ATP的結(jié)合位點(diǎn)。研究團(tuán)隊(duì)設(shè)想：如果能找到一種分子把這個(gè)“插銷”拔出來，就能激活PAK1。

研究方法：如何找到那把“鑰匙”？

1. 肽引導(dǎo)的“鎖”定位
團(tuán)隊(duì)首先從PAK1自身的“激酶抑制片段”中衍生出一個(gè)活性肽（PAP）。
原理：PAP就像一把“假插銷”，能競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到抑制片段所在的界面，把原來的“真插銷”擠出去，從而激活PAK1。
作用：利用PAP作為分子探針，通過表面等離子體共振（SPR）和AlphaFold2結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，團(tuán)隊(duì)成功定位了一個(gè)此前未被報(bào)道的“自身抑制釋放位點(diǎn)”（位于自身抑制結(jié)構(gòu)域與激酶結(jié)構(gòu)域之間），并將其命名為DEK motif。

2. 虛擬篩選與高通量實(shí)驗(yàn)
以DEK motif為靶點(diǎn)，團(tuán)隊(duì)對(duì)約200萬個(gè)小分子進(jìn)行了虛擬篩選，結(jié)合RapidFire-MS高通量酶活篩選，初步獲得JB79等激活劑（圖1F）。通過結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（SAR）優(yōu)化，得到活性更強(qiáng)的JB120。

3. 精準(zhǔn)“畫像”：光親和標(biāo)記-質(zhì)譜（PAL-MS）
為進(jìn)一步精確定位結(jié)合位點(diǎn)，團(tuán)隊(duì)合成了帶有光交聯(lián)基團(tuán)的JB120-PAL探針。通過光親和標(biāo)記-質(zhì)譜技術(shù)，他們鑒定出與激活劑直接結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基（如圖2E所示），最終將結(jié)合口袋精確定位在DEK motif區(qū)域。

4. 從“老藥”中挖掘新用途
基于PAL-MS精確定位的口袋，團(tuán)隊(duì)再次進(jìn)行虛擬篩選，從FDA批準(zhǔn)藥物庫(kù)中意外發(fā)現(xiàn)PAK1-A1（艾曲波帕）和PAK1-A2，兩者均能高效激活PAK1（圖3B）。

5. 多維度機(jī)制驗(yàn)證
團(tuán)隊(duì)綜合運(yùn)用了天然質(zhì)譜（native MS）、FRET生物傳感器、氫氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）和分子動(dòng)力學(xué)模擬，從不同角度證實(shí)了激活劑結(jié)合后，激酶抑制片段被“推開”，活性口袋暴露，PAK1發(fā)生構(gòu)象變化并啟動(dòng)自身磷酸化。

研究結(jié)果：從分子到動(dòng)物的全方位驗(yàn)證

1. 分子層面：揭示“鋼琴鍵-鎖”模型
團(tuán)隊(duì)首先驗(yàn)證了PAP的激活效果。通過SPR實(shí)驗(yàn)，他們證實(shí)PAP能夠直接結(jié)合全長(zhǎng)PAK1。AlphaFold2預(yù)測(cè)顯示，PAP結(jié)合在自身抑制結(jié)構(gòu)域與激酶結(jié)構(gòu)域的界面，將內(nèi)源的激酶抑制片段“擠開”�；�于這一發(fā)現(xiàn)，團(tuán)隊(duì)對(duì)該界面進(jìn)行虛擬篩選，獲得首個(gè)PAK1激活劑JB79。

圖1 生物活性肽引導(dǎo)的自身抑制釋放位點(diǎn)鑒定

為了明確激活劑的結(jié)合位置，團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)并合成了光親和探針JB120-PAL。通過PAL-MS分析，他們成功鑒定出多個(gè)與激活劑直接相互作用的氨基酸殘基，包括Tyr131、Glu315、Val385等，這些殘基恰好位于自身抑制結(jié)構(gòu)域與激酶結(jié)構(gòu)域的界面，進(jìn)一步驗(yàn)證了DEK motif是激活劑發(fā)揮作用的“靶心”。

圖2 PAL-MS鑒定PAK1激活劑JB120結(jié)合所依賴的自身抑制釋放位點(diǎn)中的關(guān)鍵殘基

在鎖定靶點(diǎn)后，團(tuán)隊(duì)從FDA批準(zhǔn)藥物中篩選出PAK1-A1和PAK1-A2，兩者均能劑量依賴性地激活PAK1。天然質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)顯示，PAK1-A1能夠直接結(jié)合PAK1蛋白。

圖3 靶向自身抑制釋放位點(diǎn)以發(fā)現(xiàn)變構(gòu)PAK1激活劑

更重要的是，F(xiàn)RET生物傳感器實(shí)驗(yàn)直觀地展示了激活劑與抑制劑誘導(dǎo)的相反構(gòu)象變化：PAK1-A1處理使PAK1發(fā)生大幅構(gòu)象重排，而抑制劑NVS-PAK1-1則使PAK1維持在“開放”的非活性狀態(tài)。通過定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，團(tuán)隊(duì)驗(yàn)證了關(guān)鍵殘基（如Lys141、Val318、Val385等）對(duì)PAK1-A1結(jié)合的重要性。

圖4 激活劑與抑制劑誘導(dǎo)PAK1發(fā)生不同的構(gòu)象變化

氫氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）結(jié)果顯示，PAK1-A1結(jié)合后，激酶抑制片段區(qū)域的氘交換顯著增加，表明該區(qū)域變得更為動(dòng)態(tài)、不再被“卡住”。分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)一步揭示，PAK1-A1結(jié)合后，DFG基序維持在“開”的狀態(tài)。綜合這些數(shù)據(jù)，團(tuán)隊(duì)提出了“鋼琴鍵-鎖”模型：激活劑與抑制劑競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于DFG基序相鄰的亞口袋，一個(gè)“解鎖”激酶，一個(gè)將其“鎖死”。

圖5 PAK1激活劑干擾自身抑制機(jī)制

2. 細(xì)胞層面：精準(zhǔn)激活下游信號(hào)
為全面評(píng)估PAK1-A1的細(xì)胞效應(yīng)，團(tuán)隊(duì)對(duì)H9C2心肌細(xì)胞進(jìn)行了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果顯示，PAK1-A1處理顯著改變了260多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中MAPK信號(hào)通路（尤其是MKK7-JNK分支）被顯著富集。

值得關(guān)注的是，PAK1自身（T229位點(diǎn)）磷酸化水平升高，而PAK2和PAK4的磷酸化未發(fā)生明顯變化，表明PAK1-A1具有良好的亞型選擇性。

通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)，團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步確認(rèn)PAK1-A1和PAK1-A2能夠時(shí)間依賴性地增強(qiáng)PAK1自身磷酸化，并激活其下游底物Merlin，驗(yàn)證了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)現(xiàn)。

體外激酶活性實(shí)驗(yàn)表明，PAK1-A1能夠選擇性激活PAK1，而對(duì)PAK2、PAK3無明顯激活作用，這一結(jié)果在獨(dú)立的放射性激酶實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步證實(shí)，確保了化合物的特異性。

圖6 PAK1激活劑在細(xì)胞中刺激PAK1依賴性信號(hào)傳導(dǎo)

3. 動(dòng)物模型：逆轉(zhuǎn)心肌肥厚，展現(xiàn)治療潛力
在異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的體外心肌細(xì)胞肥大模型中，PAK1-A1和PAK1-A2處理顯著抑制了心肌細(xì)胞的增大，同時(shí)降低了肥大標(biāo)志物ANP和BNP的表達(dá)水平。更重要的是，當(dāng)化合物在肥大已建立后再給藥時(shí)，仍然能夠逆轉(zhuǎn)已存在的細(xì)胞肥大，展現(xiàn)了治療而非單純預(yù)防的潛力。

在血管緊張素II（Ang II）誘導(dǎo)的小鼠心臟肥厚模型中，皮下輸注PAP能有效減輕心臟質(zhì)量增加和室壁增厚。

團(tuán)隊(duì)還在多種模型中驗(yàn)證了治療效應(yīng)：

心肌細(xì)胞特異性PAK1敲除小鼠（PAK1 cko）：PAP的心臟保護(hù)作用在PAK1敲除小鼠中消失，明確了效應(yīng)的靶向性。

橫主動(dòng)脈縮窄（TAC）模型：JB79治療同樣改善了心臟功能、減輕了肥厚和纖維化。

E99K HCM小鼠模型（模擬人類肥厚型心肌�。�：PAK1-A2口服治療顯著改善心功能、減輕室壁厚度，并抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress）標(biāo)志物的表達(dá)，揭示了潛在的分子機(jī)制。

圖7 PAK1激活劑在細(xì)胞和小鼠心肌肥厚模型中顯示出治療效果

圖S7 PAP、JB79和PAK1-A2在心肌肥厚模型中的治療效果評(píng)估

4. 策略普適性驗(yàn)證：從PAK1到PKA
為驗(yàn)證該策略是否適用于其他激酶，團(tuán)隊(duì)將其應(yīng)用于蛋白激酶A（PKA）。他們從PKA的抑制性亞基RⅠα中設(shè)計(jì)出激活肽，通過虛擬篩選成功鑒定出PKA變構(gòu)激活劑Cpd1和Cpd2。

FRET實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這些化合物在細(xì)胞中能夠有效激活PKA。這一結(jié)果證明，“肽引導(dǎo)的自身抑制釋放位點(diǎn)篩選策略”具有可推廣性。

圖S6 激活劑誘導(dǎo)的下游PAK1信號(hào)傳導(dǎo)及靶向類似自身抑制釋放位點(diǎn)的PKA激活劑的概念驗(yàn)證鑒定，與圖6相關(guān)

一個(gè)策略，一條新路

1. 首次實(shí)現(xiàn)PAK1直接、選擇性小分子激活
該研究成功開發(fā)了首個(gè)直接靶向PAK1的小分子變構(gòu)激活劑，填補(bǔ)了該領(lǐng)域的重要空白。

2. 提出可推廣的激酶激活劑發(fā)現(xiàn)策略
通過“肽引導(dǎo)→定位自身抑制釋放位點(diǎn)→虛擬篩選→結(jié)構(gòu)優(yōu)化”的理性設(shè)計(jì)流程，為其他激酶激活劑的研發(fā)提供了全新范式。

3. 驗(yàn)證激酶激活劑在心血管疾病中的治療潛力
在多種心肌肥厚模型中，PAK1激活劑展現(xiàn)出預(yù)防與治療雙重效果，為臨床上缺乏有效治療手段的肥厚型心肌�。℉CM）提供了新的藥物候選。

4. 深化對(duì)激酶調(diào)控機(jī)制的理解
提出的“鋼琴鍵-鎖”模型，揭示了同一調(diào)控界面如何通過細(xì)微差異實(shí)現(xiàn)“激活”與“抑制”的切換，為未來設(shè)計(jì)更精準(zhǔn)的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑提供了理論指導(dǎo)。

長(zhǎng)期以來，激酶激活劑的研發(fā)被視為“硬骨頭”。這項(xiàng)研究不僅啃下了這塊骨頭，更重要的是總結(jié)出了一套可復(fù)制的方法論。從PAK1到PKA，從肽探針到小分子，從分子機(jī)制到動(dòng)物療效，這項(xiàng)研究為“如何理性設(shè)計(jì)激酶激活劑”交出了一份近乎完美的答卷。

隨著這一策略的推廣，我們有理由期待，未來將有更多針對(duì)心力衰竭、神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病等領(lǐng)域的激酶激活劑問世，為那些“需要被激活”的疾病帶來新的治療希望。