2026年3月，一項(xiàng)發(fā)表于《自然通訊》（Nature Communications）的研究，為解決超分辨率熒光成像中長(zhǎng)期存在的技術(shù)瓶頸提供了一個(gè)全新的通用型蛋白標(biāo)記系統(tǒng)。這項(xiàng)研究開(kāi)發(fā)了名為FLEXTAG（Fluorescent Labeling for Exchangeable, X-resilient Tagging in Advanced Generic Nanoscopy）的框架，其核心是三個(gè)彼此正交、尺寸超�。�12-18 kDa）且具有“自我更新”能力的蛋白標(biāo)簽。該系統(tǒng)通過(guò)有機(jī)熒光染料的持續(xù)交換，顯著緩解了光漂白問(wèn)題，并兼容包括SIM（結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡）、STED（受激發(fā)射損耗顯微鏡）、STORM（隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡）和PAINT（點(diǎn)積累成像納米拓?fù)湫g(shù)）在內(nèi)的主流超分辨成像模式。尤為重要的是，研究團(tuán)隊(duì)還創(chuàng)新性地開(kāi)發(fā)了“保護(hù)性固定”方法與化學(xué)封閉策略，有效克服了化學(xué)固定導(dǎo)致的標(biāo)記效率下降和非特異性熒光背景問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了在活細(xì)胞和固定細(xì)胞中均能進(jìn)行高質(zhì)量、抗光漂白的多色超分辨成像。

這項(xiàng)重要工作的主要完成者包括Han Zhang, Yuan Yao, Xuye Wang, Yuanmin Zheng, Shaoqing Zhang, Yuan Tao, Haopeng Yang, Yinqi Wang, Mengde Liu, Marina Feric 和 Ruobo Zhou。他們共同完成的論文《FLEXTAG: a small and self-renewable protein labeling system for anti-fading multi-color super-resolution imaging》于2026年3月在線發(fā)表。

重要發(fā)現(xiàn)
本研究系統(tǒng)性地開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了FLEXTAG蛋白標(biāo)記系統(tǒng)，旨在克服當(dāng)前超分辨成像中蛋白標(biāo)簽技術(shù)的四大主要局限：快速光漂白、標(biāo)簽誘導(dǎo)的蛋白錯(cuò)誤定位與聚集假象、固定后標(biāo)記效率低下以及有限的多色復(fù)用能力。FLEXTAG通過(guò)整合三個(gè)精心工程化改造的小尺寸自我更新標(biāo)簽、一套保護(hù)性固定方案以及優(yōu)化的封閉策略，為長(zhǎng)時(shí)程、多色、納米精度的細(xì)胞成像提供了一個(gè)“一站式”解決方案。

FLEXTAG1的開(kāi)發(fā)：其前體來(lái)源于人源蛋白BRD4的第二溴結(jié)構(gòu)域（BRD4BD2）的一個(gè)突變體（L55A），原本用于靶向蛋白降解。研究首先證實(shí)其配體ET-JQ1在成像條件下對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性溴結(jié)構(gòu)域蛋白的結(jié)合可忽略不計(jì)。隨后，為克服該蛋白強(qiáng)烈的二聚化傾向?qū)е碌臉?biāo)記蛋白聚集問(wèn)題，團(tuán)隊(duì)利用ColabFold人工智能工具預(yù)測(cè)其二聚界面，并引入關(guān)鍵點(diǎn)突變（H105A, M120G）以破壞二聚化。最終獲得的突變體BRD4BD2L55A, H105A, M120G在保持高標(biāo)記效率的同時(shí)，極大地減少了聚集，被確立為FLEXTAG1。即使在后續(xù)保護(hù)性固定所需的高濃度配體存在下，也未誘發(fā)顯著聚集。

FLEXTAG2的開(kāi)發(fā)：以前人大腸桿菌二氫葉酸還原酶（eDHFR）的非共價(jià)標(biāo)簽系統(tǒng)為基礎(chǔ)。為提高其相對(duì)較低的標(biāo)記效率，研究者假設(shè)eDHFR固有的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性是原因之一。他們通過(guò)引入能夠形成分子內(nèi)二硫鍵的突變（P89C）并在N端添加一段多甘氨酸連接子（C(G)5），設(shè)計(jì)出了C(G)5-eDHFRP89C變體。該變體通過(guò)穩(wěn)定蛋白構(gòu)象，將標(biāo)記效率提升了約3.3倍，同時(shí)保持了單體狀態(tài)和快速配體交換動(dòng)力學(xué)，非常適合PAINT成像，因此被命名為FLEXTAG2。

FLEXTAG3的開(kāi)發(fā)：基于人源FKBP蛋白的F36V突變體。盡管其配體SLF’結(jié)合親和力極高，但交換動(dòng)力學(xué)過(guò)慢，不利于自我更新。為此，團(tuán)隊(duì)篩選了配體結(jié)合口袋附近的一系列單點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)I91A突變（FKBPF36V, I91A）能在維持足夠標(biāo)記亮度的同時(shí)，顯著加快配體交換速率，從而使其兼容PAINT成像。該變體被確定為FLEXTAG3。雖然其仍存在約20%的輕微二聚化傾向，但處于可接受范圍。

保護(hù)性固定方法：為解決標(biāo)記效率下降，團(tuán)隊(duì)提出了“保護(hù)性固定”策略。在固定前，用高濃度、無(wú)熒光的FLEXTAG配體（如ET-JQ1、TMP、SLF’）預(yù)處理活細(xì)胞，使其預(yù)先占據(jù)標(biāo)簽的結(jié)合口袋。隨后，在固定液中也包含這些配體的情況下進(jìn)行固定。這種方法能有效“鎖住”標(biāo)簽的配體結(jié)合構(gòu)象，屏蔽交聯(lián)反應(yīng)，從而在固定后大幅保留標(biāo)簽的可及性。實(shí)驗(yàn)表明，此方法能將固定后標(biāo)簽的標(biāo)記效率恢復(fù)至活細(xì)胞水平的49.7%到72.2%，較傳統(tǒng)固定有3.1到8.8倍的提升。

兼容SMLM技術(shù)（PAINT, STORM）：FLEXTAG配體與標(biāo)簽的動(dòng)態(tài)、可逆結(jié)合本質(zhì)上是PAINT成像的理想機(jī)制。研究展示了所有三個(gè)FLEXTAG標(biāo)簽在2D和3D PAINT成像中的優(yōu)異表現(xiàn)，并實(shí)現(xiàn)了與phalloidin-PAINT探針結(jié)合的三色成像。在更具挑戰(zhàn)的活細(xì)胞STORM成像中，團(tuán)隊(duì)將FLEXTAG3與光開(kāi)關(guān)染料HMSiR結(jié)合。在長(zhǎng)達(dá)4.5分鐘的連續(xù)成像中，F(xiàn)LEXTAG3保持了96.6%的單分子定位點(diǎn)，而對(duì)照的非更新型HaloTag信號(hào)衰減超過(guò)70%。這證明了FLEXTAG-STORM能夠支持對(duì)線粒體動(dòng)力學(xué)等過(guò)程的長(zhǎng)時(shí)間、高分辨率活細(xì)胞觀測(cè)。

FLEXTAG是一個(gè)集小型化、最小聚集性、自我更新能力和高度正交性于一體的綜合性蛋白標(biāo)記框架。它成功克服了現(xiàn)有標(biāo)簽系統(tǒng)在光穩(wěn)定性、標(biāo)記準(zhǔn)確性、固定細(xì)胞兼容性和多色能力方面的關(guān)鍵限制，為在活細(xì)胞和固定細(xì)胞中進(jìn)行長(zhǎng)期、多色、納米精度的超分辨率成像研究提供了一個(gè)強(qiáng)大而通用的工具。

創(chuàng)新與亮點(diǎn)
本研究最主要的創(chuàng)新在于系統(tǒng)性地攻克了超分辨成像蛋白標(biāo)記領(lǐng)域的多個(gè)長(zhǎng)期痛點(diǎn)。首先，它創(chuàng)造了目前性能最均衡的自我更新蛋白標(biāo)簽：相比已有的dHaloTag，F(xiàn)LEXTAG尺寸小一半（<20 kDa），更少引起蛋白錯(cuò)誤定位；相比基于熒光蛋白發(fā)色團(tuán)的pFAST等標(biāo)簽，F(xiàn)LEXTAG兼容更亮、更多樣化的有機(jī)染料，光穩(wěn)定性和亮度顯著提升。其次，它創(chuàng)新性地提出了“保護(hù)性固定”方案，首次有效解決了自我更新標(biāo)簽在固定細(xì)胞中標(biāo)記效率驟降的難題，將此技術(shù)的應(yīng)用范圍從活細(xì)胞拓展至固定樣本，為連接動(dòng)態(tài)成像與超微結(jié)構(gòu)分析（如關(guān)聯(lián)光鏡電鏡）鋪平了道路。第三，它展現(xiàn)了真正的“一標(biāo)多用”通用性，同一套FLEXTAG標(biāo)記的樣本，可根據(jù)分辨率、速度等不同需求，無(wú)縫切換至SIM、STED、PAINT或STORM等不同原理的超分辨顯微鏡進(jìn)行成像，極大提升了實(shí)驗(yàn)靈活性。

總結(jié)與展望
總而言之，F(xiàn)LEXTAG通過(guò)集成三個(gè)小型化、自更新的正交蛋白標(biāo)簽，輔以創(chuàng)新的樣品制備方法，構(gòu)建了一個(gè)強(qiáng)大而通用的超分辨成像標(biāo)記框架，顯著推進(jìn)了納米尺度生命過(guò)程可視化能力。展望未來(lái)，該系統(tǒng)的應(yīng)用潛力巨大。一方面，可進(jìn)一步探索其在關(guān)聯(lián)光鏡-電鏡（CLEM）中的價(jià)值，將FLEXTAG揭示的蛋白動(dòng)態(tài)信息與電鏡提供的超微結(jié)構(gòu)上下文精準(zhǔn)整合。另一方面，其小型化和高保真的特性使其非常適合用于標(biāo)記內(nèi)源基因位點(diǎn)，結(jié)合CRISPR等技術(shù)，有望在更接近生理的條件下研究?jī)?nèi)源蛋白的行為。此外，繼續(xù)開(kāi)發(fā)光譜范圍更廣、亮度更高、交換動(dòng)力學(xué)更優(yōu)的新型配體-染料組合，將進(jìn)一步提升FLEXTAG在深度多色成像和高速動(dòng)態(tài)觀測(cè)中的性能邊界。

DOI:10.1038/s41467-026-69658-9.