一、CRBN作為沙利度胺靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)
沙利度胺是由戊二酰亞胺和鄰苯二甲酰亞胺組成的化合物，其衍生物來(lái)那度胺和波馬利度胺統(tǒng)稱為免疫調(diào)節(jié)酰亞胺藥物，主要用于治療多發(fā)性骨髓瘤等血液系統(tǒng)惡性腫瘤。沙利度胺是歷史上最嚴(yán)重的藥物災(zāi)難之一，但由于其臨床價(jià)值和新穎的作用機(jī)制，引起了廣泛關(guān)注。利用納米磁珠技術(shù)，研究者將沙利度胺的羧基衍生物固定在磁性顆粒上，用于細(xì)胞提取物的親和純化，特異性純化了CRBN和DDB1，鑒定為沙利度胺結(jié)合蛋白。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CRBN是直接與沙利度胺結(jié)合的蛋白，而DDB1通過(guò)CRBN間接結(jié)合。CRBN和DDB1與Cullin 4和Ring-Box 1共同形成E3泛素連接酶復(fù)合物CRL4CRBN。這一發(fā)現(xiàn)是蛋白質(zhì)降解劑快速發(fā)展中的突破。TR-FRET CRBN配體篩選檢測(cè)試劑盒可用于定量檢測(cè)化合物與CRBN的結(jié)合活性，為配體篩選提供技術(shù)工具。

二、CRL4CRBN的結(jié)構(gòu)與功能
CRBN是Cullin 4 RING E3泛素連接酶的底物識(shí)別受體，由與細(xì)菌Lon蛋白酶相似的N端Lon樣結(jié)構(gòu)域和C端沙利度胺結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成。DDB1結(jié)合到CRBN的中心區(qū)域，而TBD中的三個(gè)色氨酸殘基是沙利度胺結(jié)合所必需的。DDB1由三個(gè)β-螺旋槳結(jié)構(gòu)域組成，CRBN結(jié)合在BPA和BPC之間的空腔上。沙利度胺的谷二酰亞胺部分對(duì)與CRBN的結(jié)合至關(guān)重要，其戊二酰亞胺環(huán)插入由三個(gè)色氨酸殘基和一個(gè)苯丙氨酸殘基組成的疏水口袋，鄰苯二酰亞胺環(huán)向外突出并暴露在CRBN表面。TR-FRET技術(shù)可應(yīng)用于研究化合物與CRBN結(jié)合后的構(gòu)象變化，評(píng)估不同條件下配體-受體相互作用的動(dòng)態(tài)變化。

三、分子膠降解劑的作用機(jī)制
沙利度胺及其衍生物主要通過(guò)與CRBN結(jié)合并改變其底物特異性來(lái)發(fā)揮藥理活性。沙利度胺衍生物作為分子膠，促進(jìn)E3泛素連接酶與特定靶蛋白結(jié)合并導(dǎo)致其降解。在沙利度胺或其衍生物存在時(shí)，CRL4CRBN可識(shí)別并降解非天然底物，這些統(tǒng)稱為新底物。包含新底物、IMiD和CRBN的復(fù)合物的三級(jí)結(jié)構(gòu)研究表明，新底物的β-發(fā)夾環(huán)與CRBN和來(lái)那度胺提供的表面結(jié)合。沙利度胺衍生物是目前唯一具有臨床效益的蛋白質(zhì)降解物。TR-FRET CRBN配體篩選檢測(cè)試劑盒可用于篩選能夠與CRBN結(jié)合并改變其底物特異性的分子，評(píng)估其作為分子膠的潛力。

四、PROTAC技術(shù)的發(fā)展
PROTACs于2001年首次被報(bào)道，該化合物含有一個(gè)膜不透的磷酸肽片段，不能針對(duì)細(xì)胞內(nèi)的靶蛋白進(jìn)行降解。沙利度胺作用機(jī)制的揭示促進(jìn)了PROTACs的快速發(fā)展。對(duì)于基于CRBN的PROTACs，沙利度胺或其衍生物用于E3結(jié)合位點(diǎn)。針對(duì)多種靶蛋白的基于CRBN的PROTACs已被報(bào)道。提出了CLIPTACs作為一種新策略以改善大分子量導(dǎo)致的不良藥代動(dòng)力學(xué)，通過(guò)兩個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)良好的前體點(diǎn)擊化學(xué)在細(xì)胞中產(chǎn)生PROTACs。利用光激活或滅活PROTACs的光可控PROTACs也被開(kāi)發(fā)出來(lái)解決靶上-組織外毒性。PROTAC技術(shù)在抗癌藥物領(lǐng)域受到特別關(guān)注，目前有一些PROTACs正在臨床試驗(yàn)中。TR-FRET技術(shù)可應(yīng)用于評(píng)估PROTAC分子中CRBN配體部分的結(jié)合活性，為PROTAC設(shè)計(jì)提供定量數(shù)據(jù)支持。

五、蛋白質(zhì)降解劑的未來(lái)展望
在過(guò)去的十年中，對(duì)沙利度胺作用機(jī)制的理解取得了重大進(jìn)展。推動(dòng)這一進(jìn)展的突破是發(fā)現(xiàn)CRBN作為沙利度胺的直接靶點(diǎn)。沙利度胺及其衍生物作為分子膠，改變CRBN的底物特異性，導(dǎo)致各種新底物的降解。這一發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了對(duì)沙利度胺及其衍生物多種藥理作用的分子理解，包括抗骨髓瘤和致畸作用。分子膠降解劑臨床用途的證明引發(fā)了蛋白質(zhì)降解劑開(kāi)發(fā)的快速發(fā)展，包括PROTACs。TR-FRET CRBN配體篩選檢測(cè)試劑盒為研究CRBN與配體的相互作用提供了靈敏、高效的檢測(cè)工具，可應(yīng)用于分子機(jī)制研究、藥物篩選和臨床前評(píng)價(jià)。

六、研究總結(jié)
CRBN作為沙利度胺靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)是蛋白質(zhì)降解劑發(fā)展中的重要突破�；�于CRBN的分子膠降解劑和PROTACs為靶向"不可成藥"蛋白提供了新策略。TR-FRET CRBN配體篩選檢測(cè)試劑盒在該類藥物研發(fā)中具有重要應(yīng)用價(jià)值，可提供高通量、高靈敏度的結(jié)合活性檢測(cè)。未來(lái)研究將進(jìn)一步探索CRBN與其他E3連接酶的協(xié)同作用，開(kāi)發(fā)具有更高選擇性和更好藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的下一代蛋白質(zhì)降解劑。隨著對(duì)CRBN功能機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入，蛋白質(zhì)降解劑在治療中的應(yīng)用前景將持續(xù)拓展。

基于TR-FRET技術(shù)的CRBN配體篩選在蛋白質(zhì)降解劑研發(fā)中的應(yīng)用-南京優(yōu)愛(ài)(UA BIO), 重組蛋白專家