方案摘要：繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory syndrome，PRRS），是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory syndrome virus，PRRSV）感染豬引起的一種高度傳染性疫病，臨床表現(xiàn)為母豬繁殖系統(tǒng)障礙，斷奶仔豬消瘦、生長(zhǎng)遲緩以及死亡率增加。該病能引起豬只體溫升高、呼吸困難，導(dǎo)致豬耳朵發(fā)紺，又稱藍(lán)耳病，本方案覆蓋 PRRSV 病毒分離（含病料預(yù)處理、敏感細(xì)胞接種、無病變時(shí)盲傳純化）與后續(xù)鑒定環(huán)節(jié)：分離階段，通過移液器精準(zhǔn)移取病料上清、抑菌抗生素及細(xì)胞培養(yǎng)液，嚴(yán)格把控接種體積與盲傳移液量；鑒定階段，借助移液器定量分配抗體、洗滌液、底物液等，保障試劑用量一致性。核心通過精準(zhǔn)移液消除體積誤差、更換吸頭防控交叉污染，為實(shí)驗(yàn)重復(fù)性與結(jié)果準(zhǔn)確性提供關(guān)鍵支撐。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
      豬繁殖與呼吸綜合癥病毒（PRRSV）分離與鑒定法，核心是 “先增殖再確認(rèn)”。
分離原理：PRRSV 需寄生細(xì)胞，取病料（肺、血清等）處理后，接種 Marc-145 或豬肺泡巨噬細(xì)胞，37℃培養(yǎng) 3-7 天，病毒會(huì)利用細(xì)胞復(fù)制致細(xì)胞病變（CPE），未顯 CPE 則盲傳純化。
鑒定原理：用特異性方法驗(yàn)證，如 IFA/IPMA 靠熒光 / 酶標(biāo) PRRSV 抗體結(jié)合抗原顯信號(hào)，RT-PCR 將病毒 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后，用特異引物擴(kuò)增（或測(cè)序）確認(rèn)，排除其他病毒干擾。
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-250、MSIC01-02-1000及配套吸頭；
② 二氧化碳培養(yǎng)箱（37 ℃）。
③ 冰箱（4 ℃、-20 ℃、-70 ℃）。
④ 倒置生物顯微鏡。
⑤ 恒溫水浴箱（37 ℃）。
⑥ 離心機(jī)及離心管（規(guī)格 10 mL）。
⑦ 96 孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板。
⑧ 組織研磨器。
⑨ 微孔濾器（濾膜孔徑 0.22 um）。
 
2、試劑和材料
① 細(xì)胞生長(zhǎng)液與維持液，。
② PRRSV 陽(yáng)性血清或單克隆抗體。
③ 豬原代肺泡巨細(xì)胞（PAMs）或 MARC-145 細(xì)胞。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、用 RPMI1640 細(xì)胞生長(zhǎng)液稀釋復(fù)蘇的 PAMs，細(xì)胞終濃度為每毫升 1X10⁶個(gè)/ml， 細(xì)胞，或用DMEM 細(xì)胞生長(zhǎng)液稀釋 MARC-145 細(xì)胞，細(xì)胞終濃度為每毫升5X10⁴個(gè)細(xì)胞。然后，使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，將稀釋的細(xì)胞加入 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中100 μL/孔，置于 37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)長(zhǎng)成單層。
 
2、更換新吸頭，在空白的 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入細(xì)胞培養(yǎng)液 RPMI1640，90L/孔，在A排和E排各孔內(nèi)分別加入制備好的樣本，10 μL/孔（樣本 1∶10 稀釋，重復(fù)2孔），搖動(dòng)培養(yǎng)板后，從 A排和E排孔各取10 μL，分別移入B排和F排孔內(nèi)（樣本1:100 稀釋）。搖動(dòng)培養(yǎng)板后，再?gòu)腂排和F排孔各取 10 μL分別移入 C排和 G排孔內(nèi)（樣本1:1 000 稀釋）。同樣，再?gòu)膹腃排和G排孔各取 10 L，分別移入D排和 H 排孔內(nèi)（樣本1:10 000 稀釋）。每個(gè)培養(yǎng)板應(yīng)設(shè)置不接種樣本的細(xì)胞空白對(duì)照。一般而言，對(duì)用于 PRRSV 分離的樣本進(jìn)行1:10和1:100稀釋即可。
3、吸取稀釋的樣本 50 μL，接種于對(duì)應(yīng)的細(xì)胞孔（第1代）中，吸附1h后，加入細(xì)胞維持液，100 μL/孔，置于 37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變，連續(xù)觀察2d~5 d。
 
4、樣本初次接種細(xì)胞培養(yǎng)2d后，不論有無 CPE，應(yīng)將每孔內(nèi)細(xì)胞液取 25 μL，移入按照 制備的新細(xì)胞板對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)（第2代），置于 37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2d~5 d，每天觀察 CPE。樣本的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)盲傳 2代~3代。
5、用 PRRSV陽(yáng)性血清或單克隆抗體，采用免疫過氧化物酶單層試驗(yàn)（IPMA）或間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA），對(duì)出現(xiàn)細(xì)胞病變的培養(yǎng)物進(jìn)行 PRRSV 的鑒定。
 
 
四、結(jié)果判定
1、PRRSV 感染細(xì)胞的 CPE 主要表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、聚集、固縮，最后崩解脫落。初次接種樣本和盲傳后均出現(xiàn) CPE，或盲傳后出現(xiàn) CPE，并經(jīng) IPMA 或 IFA 檢測(cè)為陽(yáng)性，判定為 PRRSV 分離陽(yáng)性。
2、初次接種樣本和盲傳后均無 CPE或出現(xiàn) CPE 但經(jīng) IPMA 或 IFA 檢測(cè)為陰性，判為 PRRSV 分離陰性。