2025年9月8日，由東方醫(yī)院曾欣團隊和中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院林勇團隊合作完成的題為“Gut-derived indole propionic acid alleviates liver fibrosis by targeting profibrogenic macrophages via the gut‒liver axis”的研究論文在《cellular & molecular immunology》發(fā)表。該研究首次證實腸源性 IPA 可通過腸-肝軸調(diào)控肝臟巨噬細胞，驅(qū)動其抗纖維化作用，為肝纖維化臨床治療提供了新的候選藥物。

南模生物為該研究提供了 Ccr2-KO（目錄號 NM-KO-190018）、Ahr-Flox（目錄號 NM-CKO-200060）、Lrat-2A-Cre（目錄號 NM-KI-190097）小鼠。

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哺乳動物體內(nèi)具有數(shù)以萬億計的微生物群，遍布各個部位，包括皮膚、唾液、口腔粘膜等部位，其中大多數(shù)存在于胃腸道。近些年，腸道微生物衍生的代謝物及功能機制逐漸被揭示，相關(guān)代謝產(chǎn)物作為機體代謝反應(yīng)的信號分子和底物，影響著宿主生理、病理等過程。

腸-肝軸作為通過門靜脈循環(huán)和膽道樹連接胃腸道和肝臟的橋梁，被認為是介導(dǎo)腸道菌群、代謝物、肝臟代謝、炎癥和免疫之間雙向串擾的關(guān)鍵模式。隨著代謝組學(xué)和其他大規(guī)模分析技術(shù)的進步，越來越多的證據(jù)闡明了腸道微生物衍生的代謝物通過腸-肝軸對纖維化的潛在和深遠影響，這為肝硬化患者的治療干預(yù)提供了潛在的靶點。

色氨酸是一種必需氨基酸，腸道中多種細菌可直接將色氨酸降解為多種代謝物，包括吲哚、吲哚乙醇（IE）、吲哚丙酸（IPA）、吲哚乳酸（ILA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚醛（IAld）、吲哚丙烯酸（IA）、甲基吲哚和色胺等。其中，吲哚丙酸IPA被認為可以緩解炎癥性腸病，并且在多種肝臟疾病中發(fā)現(xiàn)糞便和循環(huán)的IPA水平降低。

這些線索是否暗示了IPA可能影響著肝纖維化？具體機制是什么？以及是否具有靶向治療意義？

因而，研究者嘗試探索 IPA 在肝纖維化中的潛在作用。

肝硬化患者糞便中的 IPA 顯著低于對照組

研究者針對 14 名肝硬化患者與 14 名健康對照者的糞便樣本進行了宏基因組測序和代謝組學(xué)測定，并就色氨酸代謝進行相應(yīng)的分析。值得注意的是，肝硬化患者的色氨酸代謝途徑發(fā)生了顯著變化。在肝硬化患者樣本中有助于 IPA 生成的梭狀芽孢桿菌豐度降低，說明肝硬化患者色氨酸代謝相關(guān)腸道生態(tài)的紊亂。并且，肝硬化患者樣本中的 IPA、吲哚-3-羧酸（I3CA）和3-甲基吲哚（3MI）水平顯著低于健康對照者，且 IPA 與幾個肝纖維化相關(guān)指標呈顯著負相關(guān)。
 

為探索 IPA 與肝纖維化的具體聯(lián)系，研究者構(gòu)建了 CCl₄ 誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型，并使用 Cy7 標記的IPA以追蹤胃腸道 IPA 的遷移和攝取軌跡。在灌胃后三小時內(nèi)，Cy7-IPA 穿透肝臟。在連續(xù)灌胃 14 天后，門靜脈中的 IPA 濃度顯著增加，表明 IPA 可以通過腸-肝軸易位到肝臟；血清 AST、ALT、TNFα 和 IL-1β 水平明顯降低，COL1A1、COL3A1、COL6A1、α-SMA 和 TIMP 表達下調(diào)，MMP9 表達增加，說明 IPA 顯著抑制了肝纖維化。
 

圖2. IPA 可抑制 CCl₄ 誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的肝纖維化。

IPA 在抗纖維化中發(fā)揮多種作用

研究者采用單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）和批量 RNA 測序（RNA-seq）研究 IPA 對抗纖維化途徑和參與肝臟纖維化的必需纖維化細胞群的影響。RNA-seq 分析表明，IPA 可以顯著抑制促纖維化和促炎基因途徑。scRNA-seq 分析表明，在分類的 10 個細胞群中，單核細胞或巨噬細胞（單核細胞/巨噬細胞）簇在 IPA 給藥后在百分比和數(shù)量上均表現(xiàn)出最顯著的減少；并且成纖維細胞簇中纖維化特征的轉(zhuǎn)錄也被明顯抑制；此外，肝細胞簇的 scRNA-seq 分析表明 IPA 促進肝功能相關(guān)基因的表達，如肝細胞核因子（HNF）4α、HNF1α和Cyp1a2。這些數(shù)據(jù)表明 IPA 在抗纖維化中可發(fā)揮多種作用。

圖3. IPA 在抗纖維化中可發(fā)揮多種作用。

 

 

IPA 直接靶向肝臟巨噬細胞，驅(qū)動其抗纖維化作用

鑒于 IPA 在肝纖維化中的多細胞作用，研究者使用 Cy7-IPA 灌胃CCl₄ 處理后小鼠，從而確定 IPA 的直接靶細胞。結(jié)果表明，在 Cy7-IPA 灌胃后 3 小時、12 小時、48 小時和14 天，Cy7-IPA 信號主要由 F4/80 巨噬細胞捕獲�；�于 scRNA-seq 數(shù)據(jù)可知，實驗組的促纖維化和促炎通路受到抑制。

圖4. F4/80 巨噬細胞捕獲 Cy7-IPA，其促纖維化和促炎通路被抑制。

 

研究者進一步在體外模型中進行研究，使用100μM IPA或 DMSO 處理 PMA 誘導(dǎo)分化的 THP-1 細胞，并在細胞層面上進行一系列細胞因子的檢測。正如預(yù)期的那樣，IPA 降低了促纖維化和促炎細胞因子（TNFα、CCL2、TGFβ1等）的表達，并抑制了 THP-1 細胞中 NF-κB 和 Wnt/β-catenin 信號傳導(dǎo)的活性。

圖5. IPA可降低 THP-1 細胞中促纖維化和促炎細胞因子表達。

 

研究者回到小鼠模型，利用氯膦酸鹽脂質(zhì)體構(gòu)建了巨噬細胞耗竭小鼠模型，并進一步探索 IPA 在體內(nèi)的抗纖維化作用與巨噬細胞的關(guān)系。結(jié)果表明，當巨噬細胞耗竭后 IPA 在體內(nèi)的抗纖維化作用也被阻斷。以上證據(jù)表明 IPA 直接靶向肝臟巨噬細胞，驅(qū)動其抗纖維化作用。

圖6. 在巨噬細胞耗竭小鼠模型中，IPA 的抗纖維化用被阻斷。

 

 

IPA 調(diào)節(jié) AhR/NF-κB 通路，抑制巨噬細胞促纖維化功能

由于常見 IPA 受體有芳烴受體（AhR）和孕烷X受體（PXR），而巨噬細胞主要表達 AhR。因此，研究者懷疑 AhR 介導(dǎo) IPA 在巨噬細胞中的作用，并構(gòu)建了 AhR-KO 的 THP-1 細胞。結(jié)果表明，體外 AhR 缺失阻斷了 IPA 對促炎細胞因子的抑制作用，并恢復(fù)了 NF-κB 信號通路的激活。

圖7. THP-1 細胞中 AhR 的缺失影響 IPA 的抑制作用。

 

研究者進一步構(gòu)建了AhR 藥物抑制模型與巨噬細胞特異性敲除模型，結(jié)果表明AhR 拮抗劑 CH223191 阻礙了 IPA 對體內(nèi)促炎信號傳導(dǎo)和膠原蛋白沉積的抑制作用；而在巨噬細胞特異性 AhR 敲除小鼠中，IPA 的抗纖維化作用同樣被中斷。

圖8. AhR 藥物抑制與巨噬細胞特異性敲除小鼠同樣影響 IPA 的抑制作用。

 

 

IPA 抑制 S100A8/A9 巨噬細胞，改變鞘脂代謝以減弱纖維化

研究者在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中進一步分析，觀察到了 S100A8 / A9 巨噬細胞亞簇。將 S100A8/A9 巨噬細胞與其他巨噬細胞亞群進行比較的基因集變異分析 （GSVA） 顯示，S100A8/A9 巨噬細胞的纖維發(fā)生途徑顯著富集。熱圖、KEGG 分析、CellPhone DB、流式分析發(fā)現(xiàn) S100A8/A9 巨噬細胞與成纖維細胞存在互作，并且 IPA 抑制巨噬細胞促纖維化和促炎基因和通路的表達、顯著減少了體內(nèi) S100A8/A9 巨噬細胞的數(shù)量。

圖9. GSVA、熱圖、KEGG分析、CellPhone DB、流式分析等表明 IPA 減少 S100A8/A9 巨噬細胞數(shù)量，并抑制其促炎化。

 

據(jù)報道，S100A8 和 S100A9 可以上調(diào)以響應(yīng)持續(xù)炎癥，S100A8/A9 巨噬細胞富含促炎途徑，特別是 NF-κB 信號通路。AhR 與 RelA（p65）相互作用，從而抑制 p-p65 和 NF-κB 活性。研究者通過 CUT&Tag 和雙熒光素酶報告基因測定，驗證了 p65 直接與 S100A8 和 S100A9 的啟動子結(jié)合并增強其活性，明確了 IPA 通過 AhR/NF-κB/S100A8/A9 軸抑制 S100A8/A9⁺ 巨噬細胞的分化。

圖10. IPA 通過 AhR/NF-κB/S100A8/A9 軸抑制 S100A8/A9⁺ 巨噬細胞的分化。

 

鞘脂代謝是各種炎癥性疾病中巨噬細胞炎癥反應(yīng)的觸發(fā)因素。作為鞘脂代謝途徑中的主要代謝產(chǎn)物，S1P 具有強大的促炎和促纖維化功能，可加重肝臟纖維化。而在THP-1 細胞中使用IPA、AhR 激動劑/拮抗劑處理，ELISA 顯示 IPA 降低了 S1P 水平，而這種降低被 AhR 拮抗劑阻斷，表明 IPA 通過改變鞘脂代謝而減弱巨噬細胞促纖維化和促炎表型，從而減輕肝纖維化。

圖11. IPA 抑制 S100A8/A9 巨噬細胞，改變鞘脂代謝以減弱纖維化。

 

IPA 通過巨噬細胞-造血干細胞軸改善肝纖維化

為了確定 IPA 對巨噬細胞和造血干細胞之間串擾的影響，研究者將 THP-1 和 LX2 細胞在 transwell 培養(yǎng)系統(tǒng)中共培養(yǎng)。IPA 遞送后 24 小時，共培養(yǎng)的 LX2 細胞的激活受到抑制，COL1A1、α-SMA 和 TIMP1 表達顯著降低，MMP9 表達增加，p-Smad2/3 的表達被抑制。而敲除 AhR 可有效阻斷 IPA 對 HSC 激活的抑制作用。研究者使用 3D NAC-肝臟球體來驗證IPA的抗纖維化作用，組織學(xué)、免疫組織化學(xué)染色和 ELISA 結(jié)果顯示，IPA 處理 48 小時后，肝纖維化和炎癥特征明顯受到抑制。以上研究說明 IPA 可通過巨噬細胞-造血干細胞軸改善肝纖維化。

圖11. IPA 通過巨噬細胞-造血干細胞軸改善肝纖維化。

綜上所述，研究人員發(fā)現(xiàn)了14 名肝硬化患者中的腸道菌群色氨酸代謝途徑發(fā)生顯著變化，其中關(guān)鍵代謝產(chǎn)物 IPA 與肝纖維化呈現(xiàn)顯著負相關(guān)。通過使用 CCl₄ 誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型，研究人員確定了 IPA 給藥可顯著抑制肝纖維化。借助小鼠與細胞等多種模型分析，IPA 直接靶向肝臟巨噬細胞，通過調(diào)節(jié) AhR/NF-κB 通路，調(diào)控巨噬細胞的分化與促纖維化功能�？傊�，該研究增加了對腸源性色氨酸代謝物 IPA 通過腸道-肝軸對肝纖維化的調(diào)節(jié)作用的理解，為 IPA 在開發(fā)肝纖維化治療策略中的潛力提供了令人信服的證據(jù)。

 

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