方案摘要：狂犬病毒檢測(cè)中的RT-RPA 技術(shù)，全稱為逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Reverse Transcription Recombinase Polymerase Amplification），是一種針對(duì)狂犬病毒（RNA 病毒）的快速、靈敏的分子檢測(cè)方法，核心用于體外檢測(cè)樣本中狂犬病毒的 RNA，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物檢疫、疑似病例篩查等場(chǎng)景。本方案使用了Pipetty電動(dòng)移液器，其 75g 超輕筆式設(shè)計(jì)降低手部負(fù)擔(dān)，減少肌腱炎風(fēng)險(xiǎn)，握筆式操作適配狹小加樣空間。連續(xù)分液功能使操作時(shí)間縮短 1/2-2/3，單槍可實(shí)現(xiàn) 10μL 液量 25 次重復(fù)分配，大幅提升微孔板加樣效率，為實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化提供關(guān)鍵支撐。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
       狂犬病毒檢測(cè)（RT-RPA）核心是逆轉(zhuǎn)錄與重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的協(xié)同作用，針對(duì)狂犬病毒（單鏈 RNA 病毒）特性，分兩步實(shí)現(xiàn)病毒 RNA 的高效檢測(cè)。第一步為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：樣本中提取的狂犬病毒 RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下，以 RNA 為模板合成互補(bǔ) DNA（cDNA），解決 RNA 無(wú)法直接被 DNA 聚合酶擴(kuò)增的問(wèn)題，為后續(xù)擴(kuò)增提供底物。第二步為等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)：在 37-42℃恒溫條件下，重組酶與特異性引物結(jié)合形成復(fù)合物，快速掃描 cDNA 并定位匹配序列；單鏈結(jié)合蛋白（SSB）隨即結(jié)合解開(kāi)的 DNA 單鏈，防止其復(fù)性；DNA 聚合酶沿引物 3' 端延伸，實(shí)現(xiàn) cDNA 指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。同時(shí)，反應(yīng)體系中的熒光探針或標(biāo)記引物隨擴(kuò)增釋放信號(hào)，最終通過(guò)熒光強(qiáng)度或試紙條條帶，判定樣本中是否存在狂犬病毒 RNA。
 
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250，MSIC01-03-1000；
② A2 型生物安全柜；
③ 小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)；
④ 熒光PCR 儀；
 
2、試劑和材料
① 狂大病病毒陽(yáng)性對(duì)照腦組織；
② 狂大病病毒陰性對(duì)照腦組織；
③ 特異性引物和探針。
引物 RPA-F:5'-ATGGATGCCGACAAGATTGTMTTYAAAGTYAATAATCA。
引物RPA-R:5'-CTGGTCCAGTCYTCMGGRCATGTYCCCTCAAA.
探針RPA-P:5'-TCAAATCTTTGATAGCAGGGTACTTGTACTCA(FAM-dT)AT(THF)
GA(BHQ-dT)CCACGATAATC-*。其中*代表阻止引物延伸的基團(tuán),可采用磷酸化或者 C3spacer修飾實(shí)現(xiàn)。
④ RNA 提取試劑盒(商品化試劑)。
⑤ 反轉(zhuǎn)錄-重組酶聚合酶擴(kuò)增(RT-RPA)試劑盒(商品化試劑)。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、分別從不同部位待檢腦組織(至少應(yīng)包含腦干及小腦組織)各取樣品約1g，樣品量少時(shí)可取全部組織。剪碎混勻,取其中約1g置組織勻漿器中,加入1mL生理鹽水進(jìn)行勻漿,以3000g離心2min 后取 100μL,勻漿上清于 1.5 mL滅菌離心管中。使用Pipetty電動(dòng)移液器，狂犬病病毒陽(yáng)性和陰性對(duì)照腦組織各取 100μL分別置于 1.5 mL 滅菌離心管中。唾液樣品直接取 100μL, 置于 1.5 mL滅菌離心管中。
 
2、使用Pipetty電動(dòng)移液器，使用 RNA 提取試劑盒,按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取待檢樣品和對(duì)照樣品總 RNA。
3、用無(wú) RNA 酶水將引物溶解或稀釋至濃度 10 μmol/L。
4、使用反轉(zhuǎn)錄-重組酶聚合酶擴(kuò)增(RT-RPA)試劑盒,按說(shuō)明書(shū)配制 50 μL反應(yīng)體系,設(shè)置連續(xù)分液模式，加入經(jīng)稀釋的引物 RPA-F、RPA-R 各 2.1 μL,探針 RPA-P 0.6 μL,總 RNA 模板2μL,混勻后加入混合酶反應(yīng)管(試劑盒組分),最后加入 280 mmol/L,醋酸鎂(試劑盒組分)2.5μL。同時(shí)設(shè)置狂犬病病毒陽(yáng)性對(duì)照樣品、陰性對(duì)照樣品和反應(yīng)體系空白對(duì)照(不加模板 RNA)。
 
4、配制好的反應(yīng)體系應(yīng)立即上機(jī)擴(kuò)增。使用熒光定量 PCR 儀時(shí),設(shè)置 39 ℃擴(kuò)增 30s,45 個(gè)循環(huán),于反應(yīng)全程收集 FAM 熒光信號(hào);使用等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)儀時(shí),39 ℃擴(kuò)增5 min后,取出反應(yīng)管顛倒混勻,短時(shí)離心后再以 39 ℃繼續(xù)擴(kuò)增 17.5 min,在 17.5 min 反應(yīng)全程收集 FAM 熒光信號(hào)。
 
四、結(jié)果判定
1、狂犬病病毒陰性對(duì)照樣品無(wú)熒光曲線或 Ct>42,陽(yáng)性對(duì)照樣品 Ct≤30,反應(yīng)體系空白對(duì)照無(wú)熒光曲線時(shí)判定檢測(cè)反應(yīng)成立。
2、待測(cè)樣品 Ct≤37 時(shí)判定為狂犬病病毒核酸陽(yáng)性;無(wú)熒光曲線或 Ct>42 時(shí)判定為狂犬病病毒核酸陰性;37