在蛋白互作研究中，PLA（Proximity Ligation Assay）憑借高特異性和高靈敏度，可以在細(xì)胞或組織水平直接“看見”兩種分子是否真正近距離結(jié)合。本期我們精選了三篇不同領(lǐng)域的高分文章，看看 PLA 是如何精準(zhǔn)捕捉關(guān)鍵蛋白互作，從而推動(dòng)機(jī)制解析的。

• 文章方向與領(lǐng)域：腫瘤生物學(xué)、卵巢癌、耐藥機(jī)制研究；
• 想解決的問(wèn)題：高等級(jí)漿液性卵巢癌（HGSOC）對(duì)化療產(chǎn)生耐藥性與腫瘤干細(xì)胞（CSCs）活性有關(guān)，但 TGF-β 與缺氧信號(hào)如何協(xié)同維持 CSCs 尚不清楚。
• PLA 作用與關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：研究發(fā)現(xiàn)去泛素化酶 USP9X是 TGF-β 下游效應(yīng)分子，能穩(wěn)定 HIF-2α 蛋白，從而維持 CSCs 的干性。通過(guò) PLA實(shí)驗(yàn)檢測(cè) USP9X 與 HIF-2α 的直接互作，可視化地證明兩者在缺氧和 TGF-β 信號(hào)共同作用下結(jié)合增強(qiáng)（圖1），揭示了 USP9X-HIF-2α 軸在耐藥形成中的核心作用。
• 科研啟示：PLA 在復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中，可以直接驗(yàn)證關(guān)鍵分子之間的物理互作，為機(jī)制鏈條提供堅(jiān)實(shí)證據(jù)。

圖1：PLA 顯示 TGF-β1 處理可顯著增強(qiáng) USP9X 與 HIF-2α 的近鄰信號(hào)  

• 文章方向與領(lǐng)域：神經(jīng)退行性疾病、帕金森病、激酶信號(hào)調(diào)控
• 想解決的問(wèn)題：LRRK2 激酶突變已知會(huì)致病，但在無(wú)突變的“特發(fā)性”帕金森病（iPD）患者中，野生型 LRRK2 是否被激活、如何被激活仍是未知數(shù)。
• PLA 作用與關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：作者開發(fā)了基于 PLA 的雙檢測(cè)體系：

pSer1292-LRRK2（激活狀態(tài)標(biāo)志）→ 圖2 A（PLA 紅色信號(hào)）和圖 2B（定量結(jié)果）；

LRRK2 與 14-3-3 蛋白互作（抑制狀態(tài)標(biāo)志）→ 圖 2D（PLA 紅色信號(hào)）和圖2E（定量結(jié)果）；
在患者黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元中，PLA 顯示 pSer1292 信號(hào)增強(qiáng) 6 倍（2A/2B），14-3-3 結(jié)合信號(hào)降低 5 倍（2D/2E），證實(shí)了野生型 LRRK2 在 iPD 中被氧化應(yīng)激異常激活，并伴隨底物 Rab10 磷酸化增加（2C）。

• 科研啟示：PLA 可用于定量化、定位化地檢測(cè)蛋白構(gòu)象變化或結(jié)合狀態(tài)的變化，非常適合研究激酶活性調(diào)控。

圖2：PLA 檢測(cè)顯示 iPD 患者黑質(zhì)中 LRRK2 激活增強(qiáng)、14-3-3 結(jié)合減少，并伴隨 Rab10 磷酸化升高

3. 環(huán)境污染與神經(jīng)元死亡：鈣信號(hào)介導(dǎo)的“異源鐵死亡”

• 文章方向與領(lǐng)域：環(huán)境健康、神經(jīng)毒理、細(xì)胞死亡機(jī)制
• 想解決的問(wèn)題：柴油廢氣顆粒（NIST DEP）能否加速神經(jīng)元 ferroptosis（鐵死亡）？分子機(jī)制是什么？
• PLA 作用與關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)：在小鼠海馬神經(jīng)元 HT22 細(xì)胞中，研究利用 PLA 檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道 IP3R 與線粒體外膜通道 VDAC1 的相互作用，發(fā)現(xiàn) NIST DEP + RSL-3 處理組 ER-線粒體接觸位點(diǎn)顯著增加（圖3），提示鈣過(guò)載通過(guò) ER-mitochondria 接觸增強(qiáng)，推動(dòng) ferroptosis 發(fā)生。干預(yù)鈣信號(hào)（MCUi4、CyPPA）可明顯降低這PLA信號(hào)并改善細(xì)胞存活。
• 科研啟示：PLA不僅能驗(yàn)證兩個(gè)蛋白是否結(jié)合，還能用來(lái)反映細(xì)胞器之間的功能性接觸變化，拓展了蛋白互作研究的應(yīng)用邊界。

圖3：NIST DEP 與 RSL-3 增強(qiáng)神經(jīng)元 ER-線粒體接觸，MCUi4 或 CyPPA 可抑制