方案摘要：本方案旨在明確Pipetty電動(dòng)移液器在牛羊副流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)中的應(yīng)用流程與核心價(jià)值。牛羊副流感是由副流感病毒引起的呼吸道傳染病，快速精準(zhǔn)檢測(cè)病毒核酸對(duì)疫病防控至關(guān)重要。RT-PCR技術(shù)因高特異性、高靈敏度成為該病毒檢測(cè)的核心方法，而移液精準(zhǔn)度直接影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性。本方案通過整合Pipetty系列電動(dòng)移液器的精準(zhǔn)移液、連續(xù)分液等功能，應(yīng)用于樣本核酸提取、反轉(zhuǎn)錄及Real-time RT-PCR反應(yīng)體系配制等關(guān)鍵步驟，結(jié)合熒光定量RT-PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)BPIV3和CPIV3的快速、精準(zhǔn)檢測(cè)，為牛羊副流感的臨床診斷與疫病防控提供技術(shù)支撐。
 
方案詳情：

• 實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)基于RT-PCR與熒光定量技術(shù)檢測(cè)牛羊副流感病毒（BPIV3、CPIV3）核酸。病毒為單股負(fù)鏈RNA，經(jīng)提取后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過特異性引物探針擴(kuò)增目標(biāo)cDNA，熒光儀實(shí)時(shí)檢測(cè)信號(hào)并記錄Ct值，結(jié)合陰陽性對(duì)照判定樣本是否感染。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、儀器設(shè)配
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下：
① Pipetty 電動(dòng)移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 熒光定量PCR儀；
③ 臺(tái)式離心機(jī)；
④ 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)；
⑤ 冰箱(2C~8℃、-20℃、-70℃等不同規(guī)格)；
⑥ 生物安全柜。
 
2、試劑和材料
① 病毒RNA 提取試劑盒；
② 反轉(zhuǎn)錄試劑盒；
③ Real-time RT-PCR預(yù)混液或一步法 Real-time RT-PCR預(yù)混液；
④ Real-time RT-PCR用引物和熒光探針；
⑤ BPIV3陽性對(duì)照；
⑥ CPIV3陽性對(duì)照；
⑦ 離心管(0.5mL、1.5mL、2mL、10mL、50mL等不同規(guī)格)；
⑧ 熒光定量PCR反應(yīng)管。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、樣本經(jīng)預(yù)處理后取上清，采用Pipetty電動(dòng)移液器精準(zhǔn)移取樣本至提取管，配合病毒RNA提取試劑盒完成核酸提取。
2、用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的核酸進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆�。若使用一步法熒光定量RT-PCR預(yù)混液可省略此步驟。
3、將Real-time RT-PCR反應(yīng)各試劑置于冰上融化后，使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，配制Real-timeRT-PCR反應(yīng)體系，將cDNA模板分別加入相應(yīng)熒光定量PCR反應(yīng)管中，同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照和陰性對(duì)照(去離子水)，對(duì)反應(yīng)管進(jìn)行編號(hào)。蓋緊管蓋后，500r/min離心30s。
2×探針法定量PCR Mix      10μL
上游引物                   1μL
下游引物                   1μL
探針（10μmol/L）          1μL
無核酶的雙蒸水             6μL
cDNA模板                 1μL
總體積                     20μL
 
4、將加樣后的熒光定量 PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR儀中，Real-time RT-PCR檢測(cè)病毒核酸的反應(yīng)程序，按照表D.4進(jìn)行。
 
 
四、結(jié)果判定
1、陰性對(duì)照Ct值>35，且無典型擴(kuò)增曲線;陽性對(duì)照Ct值≤35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判為試驗(yàn)成立。否則應(yīng)重新進(jìn)行試驗(yàn)。
2、被檢樣品Ct值≤35，且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為病毒核酸檢測(cè)陽性;被檢樣品無Ct值或無特異性擴(kuò)增曲線，判為病毒核酸檢測(cè)陰性。被檢樣品Ct值>35，且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，需復(fù)檢。復(fù)檢Ct值>35，且出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判為病毒核酸檢測(cè)陽性;無Ct值或無特異性擴(kuò)增曲線，判為病毒核酸檢測(cè)陰性。BPIV3和CPIV3檢測(cè)結(jié)果圖分別見圖E.3和圖E.4。