方案摘要：本方案結(jié)合了Pipetty電動移液器的產(chǎn)品優(yōu)勢，通過精準(zhǔn)移取實(shí)驗(yàn)試劑與樣品，保障核酸提取、PCR反應(yīng)體系配制等關(guān)鍵步驟的準(zhǔn)確性與重復(fù)性，減少人為操作誤差導(dǎo)致的檢測偏差，實(shí)現(xiàn)對豬臨床樣品中副豬格拉瑟菌的快速、靈敏、特異性檢測，為臨床疫病診斷與防控提供可靠技術(shù)支撐。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
副豬格拉瑟菌為革蘭氏陰性菌，是引起豬格拉瑟氏病的病原體，可導(dǎo)致豬出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎、胸膜炎、腦膜炎等癥狀，對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)基于熒光實(shí)時PCR技術(shù)，利用副豬格拉瑟菌特異性引物與MGB探針，針對病原體基因組中保守序列進(jìn)行靶向擴(kuò)增。在PCR擴(kuò)增過程中，探針與目的片段特異性結(jié)合，隨著擴(kuò)增循環(huán)進(jìn)行，熒光信號不斷累積，通過實(shí)時熒光PCR儀檢測熒光信號變化，可實(shí)現(xiàn)對樣品中副豬格拉瑟菌的定性檢測。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、儀器設(shè)配
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
① Pipetty 電動移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 自動化核酸提取儀；
③ 實(shí)時熒光PCR儀；
④ 臺式低溫高速離心機(jī)(最大離心力12000g以上)。
 
2、試劑和材料
① 副豬格拉瑟菌實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增用上、下游引物及探針序列；
② 陽性對照；
③ 陰性對照；
④ 核酸提取試劑盒。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、采用核酸提取試劑盒或自動化核酸提取儀提取豬臨床樣品中的副豬格拉瑟菌DNA。提取過程中，使用Pipetty電動移液器，精準(zhǔn)移取提取試劑及樣品，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，避免DNA降解或污染。提取完成后，若在2h內(nèi)進(jìn)行檢測，可將DNA置于冰上臨時保存；若需長時間存放，應(yīng)置于-20℃冰箱中保存，防止DNA降解。
 
2、每個樣品設(shè)置3個重復(fù)孔，同時設(shè)置陽性對照、陰性對照各3個重復(fù)孔，按以下比例配制25μL反應(yīng)體系，所有試劑均通過Pipetty電動移液器精準(zhǔn)移取：
10×PCR緩沖液（含Mg²⁺）            2.5μL
dNTPs混合物                          2.0μL                
上游引物（FQ-P1）                    0.5μL
下游引物（FQ-P2）                    0.5μL
MGB探針                              0.5μL
ExTag DNA聚合酶                      0.25μL
滅菌雙蒸水                           16.75μL
DNA模板                              2.0μL
合計                                  25μL
體系配制完成后，輕柔振蕩混勻，置于臺式低溫高速離心機(jī)中，以3000r/min離心30s，使液體全部聚集于管底，避免氣泡影響熒光信號采集。按樣品順序?qū)⒎磻?yīng)管放入實(shí)時熒光PCR儀樣品槽，做好標(biāo)記。
 
3、第一階段,94C預(yù)變性5min；第二階段，94C變性30s，60C延伸30s，40個循環(huán)，在每個循環(huán)的延伸結(jié)束時進(jìn)行熒光信號收集，熒光模式設(shè)為FAM/NONE雙標(biāo)記模式。
 
四、結(jié)果判定
1、陰性對照的檢測結(jié)果應(yīng)無特定的擴(kuò)增曲線，且Ct值>32.0或無；陽性對照的Ct值應(yīng)≤29.0，且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線；如陰性對照和陽性對照結(jié)果不滿足以上條件，此次實(shí)驗(yàn)視為無效。
2、Ct值≤29.0，而且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，則判定為副豬格拉瑟菌通用型陽性。
3、Ct值>32.0或無，并且無特定的擴(kuò)增曲線，則判定為副豬格拉瑟菌通用型陰性。
4、29.0