方案摘要：本方案旨在界定Pipetty電動(dòng)移液器在豬格拉瑟�。ǜ必i格拉瑟菌）巢式PCR檢測(cè)中的具體應(yīng)用流程，通過標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)操作，結(jié)合該移液器精準(zhǔn)、高效的液體處理優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)副豬格拉瑟菌的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。方案涵蓋實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、操作步驟及結(jié)果判定等核心環(huán)節(jié)，為畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域開展豬格拉瑟病檢測(cè)工作提供標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)參考，保障檢測(cè)結(jié)果的可靠性與重復(fù)性，助力疫病的早發(fā)現(xiàn)、早防控。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
副豬格拉瑟菌為革蘭氏陰性菌，是豬格拉瑟病的致病菌，本實(shí)驗(yàn)采用巢式PCR技術(shù)，以副豬格拉瑟菌DNA為檢測(cè)靶標(biāo)，通過兩輪特異性擴(kuò)增對(duì)靶標(biāo)基因進(jìn)行富集與擴(kuò)增。Pipetty電動(dòng)移液器精準(zhǔn)移取各反應(yīng)試劑，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化PCR反應(yīng)體系，經(jīng)擴(kuò)增儀完成循環(huán)擴(kuò)增后，通過電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，依據(jù)特異性條帶的出現(xiàn)情況判定樣品中是否含有副豬格拉瑟菌。巢式PCR技術(shù)憑借兩輪擴(kuò)增的特異性篩選，可顯著提高檢測(cè)的靈敏度與特異性，結(jié)合Pipetty電動(dòng)移液器的高精度移液能力，有效降低實(shí)驗(yàn)誤差，提升檢測(cè)準(zhǔn)確性。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、儀器設(shè)配
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
① Pipetty 電動(dòng)移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 自動(dòng)化核酸提取儀；
③ PCR擴(kuò)增儀；
④ 臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(最大離心力12000g以上)；
⑤ 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽；
⑥ 凝膠成像儀(或紫外透射儀)。
 
2、試劑和材料
① 陽性對(duì)照：滅活的副豬格拉瑟菌標(biāo)準(zhǔn)菌株；
② 陰性對(duì)照：滅菌的TSB培養(yǎng)基；
③ 上、下游引物;
④ 核酸提取試劑盒。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、采用核酸提取試劑盒或自動(dòng)化核酸提取儀提取豬臨床樣品中的副豬格拉瑟菌DNA。提取過程中，使用Pipetty電動(dòng)移液器，精準(zhǔn)移取提取試劑及樣品，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，避免DNA降解或污染。提取完成后，若在2h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，可將DNA置于冰上臨時(shí)保存；若需長(zhǎng)時(shí)間存放，應(yīng)置于-20℃冰箱中保存，防止DNA降解。
2、使用Pipetty電動(dòng)移液器精準(zhǔn)移取各試劑，構(gòu)建總體積為25μL的反應(yīng)體系，具體試劑用量如下：
10×PCR緩沖液（含Mg²⁺）      2.5μL
dNTPs（2.5 mmol/L）            2μL
引物P1                         0.5μL
引物P2                         0.5μL
ExTag DNA聚合酶（5U/μL）      0.25μL
滅菌雙蒸水                     17.25μL
上述試劑總體積為23μL，室溫融化后，使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，將上述試劑移取至PCR反應(yīng)管中，每移取一種試劑后更換槍頭，避免交叉污染。試劑加完后，將反應(yīng)管置于臺(tái)式低溫高速離心機(jī)中瞬時(shí)離心，使液體全部聚集在管底部。隨后，用Pipetty電動(dòng)移液器移取2μL制備好的樣品核酸，加入反應(yīng)管中，混勻模式，充分混勻后再次瞬時(shí)離心，確保液體完全聚集于管底，避免局部試劑濃度不均影響擴(kuò)增效果。
 
3、將配制好的反應(yīng)管放入PCR擴(kuò)增儀中，設(shè)置如下程序：95℃預(yù)變性5min，徹底打開DNA雙鏈；隨后進(jìn)入循環(huán)階段，94℃變性45s（使DNA雙鏈解旋）、58℃退火45s（使引物與靶基因特異性結(jié)合）、72℃延伸45s（DNA聚合酶催化鏈延伸），共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，確保擴(kuò)增產(chǎn)物完全延伸。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)管，置于2℃~8℃條件下保存，備用。
4、采用與第一輪相同的體積配比，構(gòu)建總體積23μL的反應(yīng)體系Ⅱ，室溫融化后，使用Pipetty電動(dòng)移液器精準(zhǔn)移取各試劑，更換槍頭防污染，室溫融化后瞬時(shí)離心，再加入2μL第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板，混勻后瞬時(shí)離心，確保反應(yīng)體系均一。
 
5、擴(kuò)增條件與上一輪一致，反應(yīng)結(jié)束后，置于2℃~8℃保存，待電泳檢測(cè)。
6、稱取1.2g瓊脂糖加入100mL核酸電泳緩沖液中加熱至沸騰，充分溶化后放涼至50℃左右，加入核酸染色劑10μL，混勻，倒入膠槽制備凝膠板。在電泳槽中加入1×TAE核酸電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。分別取樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、陰/陽性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物10μL和2μL 6×電泳上樣緩沖液混合后，分別加樣到各凝膠孔中，取5μL DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)加入一凝膠孔中。5V/cm恒壓下電泳30min左右，將電泳好的凝膠置紫外投射儀或凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，進(jìn)行判定并做好試驗(yàn)記錄。
四、結(jié)果判定
1、試驗(yàn)結(jié)果成立條件
副豬格拉瑟菌陽性對(duì)照的巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后在312bp位置出現(xiàn)特異性條帶，同時(shí)陰性對(duì)照的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后沒有任何條帶，則試驗(yàn)結(jié)果成立；否則結(jié)果不成立。
2、陽性判定
在試驗(yàn)結(jié)果成立的前提下，如果樣品的PCR產(chǎn)物電泳后在312bp位置上出現(xiàn)特異性條帶，判定為副豬格拉瑟菌通用型核酸檢測(cè)陽性。
3、陰性判定
在試驗(yàn)結(jié)果成立的前提下，如果樣品在312bp位置未出現(xiàn)特異性條帶，判定為副豬格拉瑟菌通用型核酸檢測(cè)陰性。