Pipetty電動移液器在豬水皰病RT-PCR實驗中的應用
方案摘要： 本方案旨在明確Pipetty電動移液器在豬水皰�。⊿VD）RT-PCR檢測實驗中的具體應用，規(guī)范實驗操作流程，包括核酸提取、RT-PCR反應體系配制、擴增產物檢測等關鍵步驟。相較于傳統(tǒng)手動移液器，Pipetty電動移液器具備突出的連續(xù)分液優(yōu)勢，可實現(xiàn)單次吸液、多次精準分液，有效避免手動反復吸液導致的體積誤差，同時降低長時間操作帶來的手部疲勞，大幅提升移液效率；其精準的體積控制的能力，能有效規(guī)避手動移液器因人為按壓力度不均、操作手法差異造成的移液偏差，進一步提高實驗重復性和檢測準確性，為豬水皰病的快速、精準診斷提供標準化操作依據(jù)。
方案詳情：
一、實驗原理
豬水皰�。⊿VD）是由豬水皰病病毒（SVDV）引起的一種急性、接觸性傳染病，其核酸為單股正鏈RNA。本實驗采用RT-PCR（逆轉錄-聚合酶鏈反應）技術，首先通過逆轉錄酶將SVDV的RNA逆轉錄為cDNA，再以cDNA為模板，利用特異性引物擴增SVDV的特異性基因片段（目標片段大小154bp）。
二、實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② PCR儀；
③ 臺式高速冷凍離心機；
④ 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀；
⑤ 水平電泳槽；
⑥ 凝膠成像儀(或紫外透射儀)；
⑦ 核酸提取儀；
⑧ 無核酸酶的離心管與吸頭；
⑨ PCR擴增管；
⑩ 1.5mL離心管。
2、試劑和材料
① 引物:上游引物為 5-TTCAGAATGATTGCATATGGGG-3',
下游引物為5'-TCACGTTT-GTCCAGGTTACY-3'；
② 核酸提取試劑；
③ 酚-氯仿法試劑；
④ 無核酸酶水；
⑤ RT-PCR反應試劑:一步法RT-PCR反應緩沖液、RT-PCR 酶混合液(含反轉錄酶、Tag酶和RNase抑制劑等)；
⑥ 電泳緩沖液；
⑦ 瓊脂糖；
⑧ 電泳加樣緩沖液；
⑨ DNA分子質量標準。
三、實驗步驟
1、選用酚-氯仿法、RNA提取試劑盒、自動化核酸提取儀等方式進行核酸提取。采用酚-氯仿法提取核酸按下列步驟:
a)用Pipetty電動移液器取待檢樣本、陰性對照、陽性對照各300μL，分別置于1.5mL無核酸酶離心管中，每管加入300μL變性液異硫氰酸胍或Trizol試劑，反復輕輕混勻，冰浴5min；
b)每管加入60μL 2mol/L乙酸鈉（pH4.0），輕輕混勻；
C）每管加入800μL苯酚-三氯甲烷-異戊醇混合液，輕輕顛倒混勻，冰浴5min；
D）8000r/min離心10min，將上清液轉入另一潔凈離心管;
e)加800μL異丙醇，混勻，室溫放置15min;
f) 4℃，12000 r/min，離心10 min,倒掉上清液，盡量倒干液體，留下RNA沉淀;
g)加1000μL75%(體積分數(shù))乙醇顛倒洗滌沉淀，4℃，10 000r/min,離心5min。倒干液體,室溫干燥5 min~10 min;
h)使用Pipetty連續(xù)分液模式，每管加10μL無核酸酶水，用于溶解RNA�？俁NA提取液可立即用于RT-PCR擴增，也可置于-70℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?br />
2、為每個樣品準備RT-PCR混合物，推薦為待檢的批量樣品整批準備擴增預混合體系為宜，并按照樣本數(shù)n+2+1準備反應體系。
3、RT-PCR檢測擴增預混合體系為:
---------12.5μL 2×一步法RT-PCR反應緩沖液;
---------1μL RT-PCR 酶混合液;
---------0.5μL上游引物10μmol/L;
---------0.5μL下游引物10μmol/L;
---------6.5μL無核酸酶水。
在已分裝有RT-PCR預混合體系的PCR擴增管中，分別加入4μL已提取的總RNA，蓋緊管蓋，振蕩混勻后，瞬時離心。
4、將PCR擴增管放入PCR儀中，按照設定程序進行RT-PCR擴增:50 ℃ 30 min；95 ℃5 min；然后94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個循環(huán)；最后72℃ 10 min。反應結束后,擴增產物置于4℃保存。
5、擴增產物電泳檢測:制備2%瓊脂糖凝膠，對RT-PCR擴增產物進行電泳，同時加DNA分子質量標準。電壓80 V~100 V或電流40mA~50mA，電泳20min~30min。電泳結束后,將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀(或紫外透射儀)觀察。
6、試驗成立條件：陽性對照應出現(xiàn)154bp大小的特異性擴增條帶，陰性對照無擴增條帶。
四、結果判定
符合實驗成立條件，待檢樣品擴增出特異性條帶，且與陽性對照條帶分子質量大小相符,則該待檢樣品判定為SVDV核酸陽性。待檢樣品無擴增條帶，判為SVDV核酸陰性。在需要時，可取RT-PCR擴增產物進行序列測定，測序結果與SVDV特異性片段序列進行比對。
方案詳情：
一、實驗原理
豬水皰�。⊿VD）是由豬水皰病病毒（SVDV）引起的一種急性、接觸性傳染病，其核酸為單股正鏈RNA。本實驗采用RT-PCR（逆轉錄-聚合酶鏈反應）技術，首先通過逆轉錄酶將SVDV的RNA逆轉錄為cDNA，再以cDNA為模板，利用特異性引物擴增SVDV的特異性基因片段（目標片段大小154bp）。
二、實驗準備
1、設配和材料
① Pipetty電動移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② PCR儀；
③ 臺式高速冷凍離心機；
④ 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀；
⑤ 水平電泳槽；
⑥ 凝膠成像儀(或紫外透射儀)；
⑦ 核酸提取儀；
⑧ 無核酸酶的離心管與吸頭；
⑨ PCR擴增管；
⑩ 1.5mL離心管。
2、試劑和材料
① 引物:上游引物為 5-TTCAGAATGATTGCATATGGGG-3',
下游引物為5'-TCACGTTT-GTCCAGGTTACY-3'；
② 核酸提取試劑；
③ 酚-氯仿法試劑；
④ 無核酸酶水；
⑤ RT-PCR反應試劑:一步法RT-PCR反應緩沖液、RT-PCR 酶混合液(含反轉錄酶、Tag酶和RNase抑制劑等)；
⑥ 電泳緩沖液；
⑦ 瓊脂糖；
⑧ 電泳加樣緩沖液；
⑨ DNA分子質量標準。
三、實驗步驟
1、選用酚-氯仿法、RNA提取試劑盒、自動化核酸提取儀等方式進行核酸提取。采用酚-氯仿法提取核酸按下列步驟:
a)用Pipetty電動移液器取待檢樣本、陰性對照、陽性對照各300μL，分別置于1.5mL無核酸酶離心管中，每管加入300μL變性液異硫氰酸胍或Trizol試劑，反復輕輕混勻，冰浴5min；
b)每管加入60μL 2mol/L乙酸鈉（pH4.0），輕輕混勻；
C）每管加入800μL苯酚-三氯甲烷-異戊醇混合液，輕輕顛倒混勻，冰浴5min；
D）8000r/min離心10min，將上清液轉入另一潔凈離心管;
e)加800μL異丙醇，混勻，室溫放置15min;
f) 4℃，12000 r/min，離心10 min,倒掉上清液，盡量倒干液體，留下RNA沉淀;
g)加1000μL75%(體積分數(shù))乙醇顛倒洗滌沉淀，4℃，10 000r/min,離心5min。倒干液體,室溫干燥5 min~10 min;
h)使用Pipetty連續(xù)分液模式，每管加10μL無核酸酶水，用于溶解RNA�？俁NA提取液可立即用于RT-PCR擴增，也可置于-70℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?br />
2、為每個樣品準備RT-PCR混合物，推薦為待檢的批量樣品整批準備擴增預混合體系為宜，并按照樣本數(shù)n+2+1準備反應體系。
3、RT-PCR檢測擴增預混合體系為:
---------12.5μL 2×一步法RT-PCR反應緩沖液;
---------1μL RT-PCR 酶混合液;
---------0.5μL上游引物10μmol/L;
---------0.5μL下游引物10μmol/L;
---------6.5μL無核酸酶水。
在已分裝有RT-PCR預混合體系的PCR擴增管中，分別加入4μL已提取的總RNA，蓋緊管蓋，振蕩混勻后，瞬時離心。
4、將PCR擴增管放入PCR儀中，按照設定程序進行RT-PCR擴增:50 ℃ 30 min；95 ℃5 min；然后94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40個循環(huán)；最后72℃ 10 min。反應結束后,擴增產物置于4℃保存。
5、擴增產物電泳檢測:制備2%瓊脂糖凝膠，對RT-PCR擴增產物進行電泳，同時加DNA分子質量標準。電壓80 V~100 V或電流40mA~50mA，電泳20min~30min。電泳結束后,將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀(或紫外透射儀)觀察。
6、試驗成立條件：陽性對照應出現(xiàn)154bp大小的特異性擴增條帶，陰性對照無擴增條帶。
四、結果判定
符合實驗成立條件，待檢樣品擴增出特異性條帶，且與陽性對照條帶分子質量大小相符,則該待檢樣品判定為SVDV核酸陽性。待檢樣品無擴增條帶，判為SVDV核酸陰性。在需要時，可取RT-PCR擴增產物進行序列測定，測序結果與SVDV特異性片段序列進行比對。
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