2026年3月6日，四川大學(xué)丁楅森/曹中煒等聯(lián)合中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院王辰院士等在Cell發(fā)表題為“Selective targeting of endothelial and perivascular angiocrine ROCK2 treats liver fibrosis”的研究論文。該論文揭示血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管周圍HSC中異常上調(diào)的ROCK2在肝纖維化進(jìn)展中的致病作用，明確血管微環(huán)境在纖維化持續(xù)演進(jìn)中的重要調(diào)控作用，并系統(tǒng)闡述“血管旁分泌”（Angiocrine）信號在疾病進(jìn)程中的驅(qū)動功能。并基于ROCK2靶點開展藥物設(shè)計與篩選，獲得高選擇性ROCK2抑制劑TDI01。該工作構(gòu)建了從靶點發(fā)現(xiàn)-藥物研發(fā)-臨床研究的first-in-class新藥開發(fā)全鏈條，為靶向血管Angiocrine功能的抗纖維化治療提供了理論依據(jù)與實踐基礎(chǔ)。

南模生物為該研究提供了Vav1-2A-Cre mice（目錄號：NM-KI-233228）及Lrat-2A-Cre mice（目錄號：NM-KI-190097）小鼠模型。

肝臟在損傷后會進(jìn)行自我修復(fù)，肝再生需要不同細(xì)胞類型之間的協(xié)調(diào)交互。在此過程中，異常激活的肝星狀細(xì)胞（HSCs）分化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致肝纖維化。肝纖維化不僅是多種慢性肝�。ㄈ绱�謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎MASH）的共同組織學(xué)特征，更是其向肝硬化乃至肝癌進(jìn)展的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)。盡管目前已有一系列抗纖維化候選藥物進(jìn)入臨床試驗，但臨床可用的有效治療手段仍然極為有限。因此，鑒定肝纖維化進(jìn)程中關(guān)鍵且可成藥的致纖維化分子，已成為該領(lǐng)域亟待解決的核心問題。

HSC的活化受其周圍細(xì)胞的調(diào)節(jié)，研究表明，免疫細(xì)胞可與HSCs相互作用，促進(jìn)肝纖維化。基于此，越來越多的治療候選藥物已在伴纖維化的MASH患者臨床試驗中接受測試。例如，代謝調(diào)節(jié)劑展現(xiàn)出積極療效，甲狀腺激素受體-β（THR）激動劑瑞美替羅和胰高血糖素樣肽-1（GLP1）受體激動劑司美格魯肽已相繼獲批；此外，絲裂原活化蛋白激酶激酶4（MKK4）抑制劑在臨床前模型中也被證實可促進(jìn)肝再生。然而，能有效逆轉(zhuǎn)患者肝纖維化的療法極為有限。然而，上述療法在逆轉(zhuǎn)已形成的肝纖維化方面效果仍不理想，而靶向特定致纖維化分子（如賴氨酰氧化酶樣蛋白2，LOXL2）的干預(yù)策略亦未在臨床研究中取得預(yù)期成功。因此，開發(fā)基于機(jī)制的治療藥物是肝臟疾病抗纖維化治療的迫切需求。

基于上述問題，研究團(tuán)隊進(jìn)行了以下研究：
1 ROCK2在人纖維化肝臟的血管中上調(diào)
為探究ROCK2在纖維化肝臟中的表達(dá)模式及其細(xì)胞特異性，研究團(tuán)隊首先對公開的人肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集（GEO：GSE193066和GSE173735）進(jìn)行了通路富集分析。結(jié)果表明，纖維化肝臟中顯著富集了"Rho GTPase循環(huán)"及其效應(yīng)器相關(guān)信號（圖1A）。Rho GTP酶效應(yīng)分子及Rho GTP酶循環(huán)均與ROCK家族相關(guān)，該家族是設(shè)計激酶抑制劑的理想藥物靶點（圖1B）�；�于此，團(tuán)隊進(jìn)一步通過scRNA-seq技術(shù)對人肝臟中ROCK1和ROCK2的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，與廣泛表達(dá)的ROCK1不同，ROCK2在肝臟內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）和肝星狀細(xì)胞（HSCs）中呈現(xiàn)優(yōu)先表達(dá)，且在纖維化肝臟中表達(dá)顯著上調(diào)（圖1C-E）。為在蛋白水平驗證這一發(fā)現(xiàn)，研究團(tuán)隊對人肝組織切片進(jìn)行了多重免疫熒光染色。結(jié)果顯示，ROCK2及其磷酸化活化形式（pROCK2）在纖維化肝臟的LYVE1⁺ 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs）和desmin⁺ HSCs中呈分期依賴性高表達(dá)（圖1F-I）。相反，在CD45⁺ 造血細(xì)胞和HNF4α⁺ 肝細(xì)胞中，ROCK2的表達(dá)水平極低且無顯著變化（圖1J-K）。以上數(shù)據(jù)表明，ROCK2在纖維化肝臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管周圍HSCs中選擇性上調(diào)，提示其作為抗纖維化干預(yù)靶點的潛力（圖1L）。
 

圖1. 人類纖維化肝臟中血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管周圍肝星狀細(xì)胞中ROCK2的表達(dá)上調(diào)

2 ECs和HSCs中的ROCK2在小鼠模型中促進(jìn)肝纖維化
為明確ROCK2在肝纖維化進(jìn)程中的功能細(xì)胞來源，研究團(tuán)隊構(gòu)建了內(nèi)皮細(xì)胞（EC）特異性誘導(dǎo)型ROCK2基因敲除小鼠（Rock2^iΔEC/iΔEC），并利用CCl₄誘導(dǎo)的肝纖維化模型進(jìn)行驗證（圖2A）。結(jié)果顯示，與對照小鼠相比，Rock2^iΔEC/iΔEC小鼠的肝膠原沉積顯著減少，血清轉(zhuǎn)氨酶（ALT、AST）及肝羥脯氨酸（HYP）水平均明顯下降（圖2B-E），提示內(nèi)皮細(xì)胞中ROCK2上調(diào)是驅(qū)動損傷后肝纖維化的重要因素。

進(jìn)一步，研究團(tuán)隊利用HSC特異性Lrat-Cre小鼠構(gòu)建了HSC中ROCK2缺失的小鼠（Rock2^ΔHSC/ΔHSC），并利用CCl₄誘導(dǎo)的肝纖維化模型（圖2F）。結(jié)果表明，在相同纖維化模型中，Rock2^ΔHSC/ΔHSC小鼠同樣表現(xiàn)出纖維化程度減輕，但改善幅度低于內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除小鼠（圖2G-J）。在MASH模型中，研究團(tuán)隊進(jìn)一步驗證了上述發(fā)現(xiàn)。結(jié)果顯示，內(nèi)皮細(xì)胞或HSCs中ROCK2的缺失均可顯著減輕肝纖維化、改善肝脂肪變性并降低血清轉(zhuǎn)氨酶水平（圖2K-V）。以上數(shù)據(jù)表明，ROCK2在內(nèi)皮細(xì)胞及HSCs中的上調(diào)是驅(qū)動肝纖維化進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制，靶向該分子的激酶活性有望成為抗纖維化治療的策略。
 

圖2. ECs和HSCs中ROCK2基因缺失可減輕肝纖維化和肝損傷

3 TDI01被鑒定為ROCK2選擇性抑制劑
為獲得具有臨床應(yīng)用潛力的ROCK2選擇性抑制劑，研究團(tuán)隊基于ROCK2晶體結(jié)構(gòu)及已知抑制劑骨架，通過計算機(jī)輔助藥物設(shè)計（CADD）合成686種候選化合物，并建立了一套多級篩選流程（圖3A）。首先，采用均相時間分辨熒光（HTRF）技術(shù)來鑒定特異性抑制ROCK2活性但不抑制ROCK1的化合物。初篩結(jié)果顯示，126個化合物可顯著抑制ROCK2活性，其中47個化合物對ROCK2的半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）低于45 nM（圖3B）。進(jìn)一步以ROCK1/ROCK2 IC₅₀比值大于200為標(biāo)準(zhǔn)篩選高選擇性抑制劑，共獲得41個符合要求的化合物（圖3C）。

綜合兩項指標(biāo)，共有37個化合物同時滿足強(qiáng)效（ROCK2 IC₅₀ < 45 nM）與高選擇性（選擇性指數(shù) > 200）標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)入后續(xù)藥代動力學(xué)（PK）篩選（圖3D）。結(jié)果顯示，劑8個ROCK2選擇性抑制劑具有良好暴露量（圖3E）。隨后，采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs）對上述8個化合物進(jìn)行細(xì)胞毒性評估，僅TDI01470在兩種細(xì)胞中的IC₅₀均高于20 μM，提示其細(xì)胞毒性較低（圖3F）。hERG心臟毒性試驗進(jìn)一步證實，相較于陽性對照多非利特（Dofetilide），TDI01470表現(xiàn)出最小的心臟毒性（圖3G）。大鼠PK研究也同樣表明，TDI01470口服生物利用度達(dá)56%，半衰期（T_1/2）為3.2h，暴露量呈劑量依賴性（圖3H）。

綜合上述篩選結(jié)果，TDI01470被確定為最終候選化合物，并命名為TDI01。激酶活性測定顯示，TDI01對ROCK2的IC₅₀為10.31 nM，對ROCK1的IC₅₀為6,159 nM，選擇性指數(shù)達(dá)598倍（圖3I），表明其具有高度ROCK2選擇性抑制活性。

圖3. 具有最佳藥代動力學(xué)參數(shù)和安全性的ROCK2選擇性抑制劑TDI01的鑒定

4 TDI01可直接與ROCK2結(jié)合并發(fā)揮其抑制作用
為確證TDI01與ROCK2的直接結(jié)合及其機(jī)制，研究團(tuán)隊開展了一系列分子互作與結(jié)構(gòu)研究。生物層干涉（BLI）結(jié)果顯示，TDI01與ROCK2激酶結(jié)構(gòu)域（KD）呈高親和力結(jié)合（KD=65.56 nM），而與ROCK1在濃度高達(dá)60 μM時仍無顯著結(jié)合（圖4A-B）。進(jìn)一步利用生物素標(biāo)記的TDI01在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）及肝星狀細(xì)胞LX2一起孵育，對pulled down的細(xì)胞裂解物進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，ROCK2是與生物素-TDI01結(jié)合強(qiáng)度最高的靶蛋白（圖4C-D）。功能實驗顯示，TDI01在細(xì)胞中表現(xiàn)出對ROCK2活性的劑量依賴性抑制（圖4E-F）。

為闡明TDI01的結(jié)合模式和抑制機(jī)制，研究團(tuán)隊利用冷凍電鏡解析了ROCK2 KD與TDI01復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，TDI01結(jié)合于ROCK2的ATP結(jié)合口袋，誘導(dǎo)其采取激酶非活性狀態(tài)的"DFG-out"構(gòu)象，而ROCK1因F194殘基的空間位阻無法發(fā)生該構(gòu)象變化（圖4G-J）。關(guān)鍵殘基L210在TDI01選擇性識別中起決定性作用：L210F點突變完全消除了TDI01與ROCK2的結(jié)合及其抑制活性（圖4K-O）。以上結(jié)果表明，TDI01通過與ROCK2的L210殘基特異性結(jié)合，將其鎖定于非活性構(gòu)象，從而實現(xiàn)高選擇性抑制。

圖4. TDI01作為ROCK2選擇性抑制劑的特性研究
 

圖5. TDI01在模擬人類病理學(xué)的迷你豬MASH模型中減輕纖維化

6 TDI01在人體中的1期臨床試驗
為評估TDI01在人體中的安全性、耐受性及藥代動力學(xué)（PK）特征，研究團(tuán)隊開展了一項隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照的1期臨床試驗。共入組62例健康志愿者，分別接受單次遞增劑量（400、800、1200 mg）、多次給藥（200、400 mg，每日一次，連續(xù)7天）及食物影響評估。結(jié)果顯示，TDI01在所有劑量組均表現(xiàn)出良好的安全性，未發(fā)生嚴(yán)重不良事件。PK分析顯示，TDI01口服后吸收迅速，單次給藥后血漿濃度呈雙相曲線，達(dá)峰時間（Tmax）約為4小時，半衰期（T_1/2）約8-13小時，暴露量（Cmax和AUC）呈劑量依賴性增加。多次給藥3-4天后達(dá)到穩(wěn)態(tài)，蓄積系數(shù)合理（Rac 1.68-2.39），表明每日一次給藥方案可行。食物影響研究表明，高脂餐延遲TDI01吸收（Tmax延長至7.1小時），但顯著提高暴露量（Cmax和AUC增加），提示餐后給藥可增強(qiáng)生物利用度。以上結(jié)果表明，TDI01在健康志愿者中具有良好的安全性和可預(yù)測的PK特征，支持其在肝纖維化患者中的后續(xù)臨床研究。

7 臨床研究表明TDI01有減輕患者肝纖維化的趨勢
為初步評估TDI01在肝纖維化患者中的安全性與療效，研究團(tuán)隊開展了一項劑量遞增的擴(kuò)展臨床研究。該研究設(shè)計為劑量遞增試驗，包括一個初始低劑量隊列（200 mg），隨后遞增到高劑量隊列（400 mg）。低劑量隊列（200 mg，每日一次）共納入6例經(jīng)病理活檢確診的不同分期肝纖維化患者（圖6A-B）。經(jīng)過24周治療，5例患者的肝臟硬度值（LSM）呈進(jìn)行性下降（圖6C-D）。多種無創(chuàng)纖維化指標(biāo)（S指數(shù)、GPR、RPR、FIB-4）在多數(shù)患者中呈現(xiàn)改善或維持穩(wěn)定的趨勢（圖6E-H）。肝功能指標(biāo)（ALT、AST、ALB）在治療期間總體穩(wěn)定，其中1例基線異常升高的患者轉(zhuǎn)氨酶接近恢復(fù)正常（圖6I-K）。治療期間未見嚴(yán)重不良事件，僅發(fā)生6例輕微治療相關(guān)不良事件�？偟膩碚f，在這6名接受低劑量TDI01治療的患者中，出現(xiàn)了減輕肝纖維化的趨勢，且安全性相對良好。

圖6. TDI01可緩解6例受試患者的肝纖維化程度

治療結(jié)束后對6例患者進(jìn)行二次肝活檢，病理結(jié)果顯示5例患者肝組織膠原沉積顯著減少（圖7A-B）。H&E染色顯示，5例患者的纖維化分期（METAVIR、NAFLD、Scheuer評分系統(tǒng)）均有明顯改善，其中2例基線為肝硬化的患者亦呈現(xiàn)組織學(xué)改善（圖7C-D）。多重免疫熒光染色證實，TDI01治療后患者肝組織中pROCK2水平顯著下降，而pROCK1水平無明顯變化（圖7E-F），驗證了其靶向選擇性。以上結(jié)果表明，本項小樣本探索性研究初步提示，TDI01可安全有效地減輕肝纖維化，其對ROCK2的選擇性抑制可能是其發(fā)揮抗纖維化作用的分子基礎(chǔ)。

圖7. TDI01通過抑制ROCK2活性改善纖維化

總的來說，這項研究實現(xiàn)了從靶點發(fā)現(xiàn)、藥物研發(fā)到臨床轉(zhuǎn)化的全鏈條突破，為肝纖維化治療提供了全新的靶向策略，具有重要的科學(xué)價值與臨床意義。

圖8. 研究模式圖

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