背景知識：
傳統(tǒng)CRISPR-Cas9被譽為“基因剪刀”，Cas9酶識別的前提是目標DNA旁邊存在一個“protospacer adjacent motif”（PAM）序列，但也限制了靶點的選擇范圍。工程化和表征蛋白質(zhì)可能既耗時又繁瑣，“通用型”CRISPR-Cas 酶雖然可以應(yīng)用多樣化的基因組編輯，但這類酶往往脫靶率高、切割效率低。

理想的基因編輯工具，應(yīng)針對特定靶點 “精準打擊”—— 既可以擴大靶向覆蓋，又能夠降低脫靶風險，甚至可以實現(xiàn)等位基因特異性編輯。因此，需篩選海量的酶變體并驗證其 PAM 特異性，而傳統(tǒng)實驗方法效率低下，難以應(yīng)對百萬級別的酶庫篩選需求。

2025年4月22日美國麻省總醫(yī)院和哈佛醫(yī)學院的科學家們在《Nature》雜志發(fā)表了題為“Custom CRISPR-Cas9 PAM variants via scalable engineering and machine learning”的研究文章，堪稱CRISPR技術(shù)發(fā)展的里程碑。  
研究團隊通過基于結(jié)構(gòu)/功能的飽和誘變和細菌篩選，獲得了近 1000 種工程化的SpCas9酶，并對它們的PAM需求進行了表征，以此訓練一個將氨基酸序列與 PAM 特異性聯(lián)系起來的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。并利用由此產(chǎn)生的 PAM 機器學習算法（PAMmla）預測 6400 萬種 SpCas9 酶的 PAM。PAMmla 將機器學習和蛋白質(zhì)工程深度融合，構(gòu)建了一個擁有不同 PAM 需求的 SpCas9 酶資源庫，為開發(fā)更安全、高效的 CRISPR 基因組編輯技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
 
在該研究中，GUIDE-seq2 作為全基因組脫靶效應(yīng)評估的核心技術(shù)，主要應(yīng)用于驗證 PAMmla 預測的定制化 SpCas9 酶的特異性。GUIDE-seq2可作為細胞水平、無偏好、全基因組范圍捕獲 CRISPR 切割位點的金標準技術(shù)。
 
本文中GUIDE-seq2實驗流程：
1、細胞轉(zhuǎn)染與樣本制備：將核酸酶表達質(zhì)粒、sgRNA 質(zhì)粒、dsODN 標簽與轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染 HEK 293T 細胞，72 小時后提取基因組 DNA 并定量。
2、靶向整合驗證：通過 PCR 擴增、文庫構(gòu)建和NGS測序，結(jié)合 CRISPResso2 分析，計算 dsODN 標簽在靶向位點的整合比例，評估靶向編輯效率。
3、GUIDE-seq2 核心反應(yīng)：制備含條形碼和 UMI 的 Tn5 轉(zhuǎn)座體，對基因組 DNA 進行標簽化反應(yīng)，經(jīng)蛋白酶 K 終止反應(yīng)、磁珠純化后，用特異性引物進行 PCR 擴增。
4、文庫質(zhì)控與測序：由Sage Science公司的 Pippin Prep 全自動DNA片段回收儀精準進行DNA特定片段篩選（DNA size selection）： 250-500bp 片段以純化NGS文庫，去除更長或更短的非目標DNA片段，制備高質(zhì)量二代測序文庫，提高NGS測序質(zhì)量。定量后混合為 2nM 最終文庫，使用 Illumina NextSeq1000/2000 測序。
5、數(shù)據(jù)分析：用更新版 GUIDE-seq2 軟件（max_mismatches=6）分析測序數(shù)據(jù)，鑒定全基因組范圍內(nèi)的脫靶位點，對比定制化酶與傳統(tǒng)酶（SpG、SpRY）的脫靶風險。
通過PAMmla模型，研究人員預測了全部6400萬個可能變體的PAM特異性，并從中挑選出針對不同PAM的最優(yōu)變體進行實驗驗證。GUIDE-seq2 檢測顯示，定制化酶的靶向范圍更窄，其脫靶位點數(shù)量較傳統(tǒng) “通用型” 酶減少 26%-96%。，脫靶率顯著降低。

美國Sage Science公司的全自動DNA片段回收儀為實驗提供精準片段篩選功能，為 GUIDE-seq2 等關(guān)鍵實驗提供了高純度、高質(zhì)量的測序文庫。 

通過PAMmla預測的變體在人類細胞中展現(xiàn)出優(yōu)異的性能，不僅編輯效率高，脫靶風險還大幅降低。文中研究團隊已將PAMmla模型和ISDE方法開源，提供在線工具（pammla.streamlit.app）與全庫預測數(shù)據(jù)，研究者輸入目標 PAM 即可秒級獲得定制酶序列。綜上所述，PAMmla的開發(fā)標志著基因編輯工具從"通用型"向"定制型"的轉(zhuǎn)變，為各種基因編輯應(yīng)用提供了更加安全、高效的選擇。為精準基因治療、安全堿基編輯和單等位基因疾病干預奠定技術(shù)平臺。
 
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41586-025-09021-y

廠家介紹
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Blue Pippin全自動DNA脈沖場電泳回收儀：
 
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* 用于大片段DNA（幾kb、幾十kb甚至幾百kb）精準回收，如Pacbio  HiFi文庫構(gòu)建、納米孔測序建庫、超長測序（Ultra Long Sequencing）文庫構(gòu)建等；  
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