方案摘要：本方案通過結合Pipetty電動移液器，利用其精準移液控制提升實驗重復性與準確性，保障了加樣步驟的準確性與重復性，減少人為操作誤差導致的檢測偏差，實現對豬臨床樣品中副豬格拉瑟菌的快速、靈敏、特異性檢測，為副豬格拉瑟菌感染的快速篩查與確診提供標準化實驗依據，為臨床疫病診斷與防控提供可靠技術支撐。
 
方案詳情：
一、實驗原理
間接ELISA技術基于抗原抗體特異性結合及酶催化底物顯色的原理，用于檢測樣品中針對副豬格拉瑟菌的特異性抗體。本實驗以副豬格拉瑟菌重組P2蛋白作為包被抗原，吸附于96孔酶標板表面；加入待檢血清后，血清中若存在副豬格拉瑟菌特異性抗體，會與板上包被抗原結合形成抗原-抗體復合物；再加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗豬IgG酶標抗體，該酶標抗體可與復合物中的豬IgG特異性結合；最后加入TMB底物溶液，HRP可催化底物顯色，顯色程度與待檢血清中特異性抗體含量呈正相關。通過酶標儀測定450nm波長下的吸光值，結合公式計算與判定標準，可判斷待檢樣品是否為陽性。
 
二、‌實驗準備
1、儀器設配
除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：
① Pipetty 電動移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 酶標儀；
③ 恒溫箱；
④ 洗板機或洗滌瓶；
⑤ 96孔酶標板；
⑥ U形96孔稀釋板；
⑦ 貯液槽。
 
2、試劑和材料
① 包被抗原:副豬格拉瑟菌重組P2蛋白；
② 酶標抗體:兔抗豬IgG-辣根過氧化物酶；
③ 對照:副豬格拉瑟菌抗體陽性對照(陽性血清)、陰性對照(陰性血清)；
④ 包被液、洗滌液、封閉液、樣品稀釋液、酶結合物稀釋液、終止液；
⑤ 底物溶液:商品化即用型TMB底物溶液。
三、實驗步驟
1、取96孔酶標板，使用Pipetty電動移液器，設置連續(xù)分液模式，將經包被緩沖液稀釋至工作濃度（0.5μg/mL）的副豬格拉瑟菌重組P2抗原，每孔加入100μL；置于4℃冰箱過夜（16h~22h）。棄去板中包被液，用Pipetty電動移液器每孔加入300μL洗滌液，洗滌1次，甩掉洗滌液并在吸水紙上拍干殘留液體。每孔加入120μL封閉液，置于37℃恒溫箱內孵育2h，或4℃過夜16h~22h。封閉結束后，棄去板中的封閉液，于吸水紙上拍干，室溫干燥后置于4℃干燥保存。
 
2、在U形96孔稀釋板中，用樣品稀釋液將待檢血清、陽性對照血清及陰性對照血清分別作1:100稀釋。使用Pipetty電動移液器連續(xù)分液模式，每孔加入100μL稀釋后的血清樣品，每個對照血清各做兩孔重復，將酶標板置于37℃溫箱內反應60min。取出反應板，棄去反應液，用Pipetty每孔加入300μL洗滌液，洗滌5次，每次洗滌后在吸水紙上拍干。
3、用樣品稀釋液將兔抗豬IgG-辣根過氧化物酶作1:5000稀釋至工作濃度。使用Pipetty連續(xù)分液模式，每孔加入100μL稀釋后的酶標抗體，置于37℃溫箱內反應30min。取出反應板，棄去反應液，用洗滌液每孔加300μL，洗滌3次。
4、每孔加入100μL TMB底物溶液，置于37℃溫箱內避光反應15min。
5、反應結束后，每孔加入50μL終止液，終止反應。
 
6、酶標儀讀取各孔吸光值(OD_450nm，指在波長450nm的光密度值）。
四、數據分析

 
五、結果判定