類器官的包埋處理流程與組織包埋處理流程基本一致，但由于類器官相當(dāng)于分散的許多小個體，而組織是一個大的聚合體，類器官在脫水中易散開、丟失，為了方便包埋時的夾取、確定切片位置，需要進行瓊脂糖輔助包埋處理。類器官因來源不同，形態(tài)和培養(yǎng)方式也不一樣，收集的困難程度也各有差異，根據(jù)不同的類器官可以采用不同的收集方法，使用不同的瓊脂糖包埋法進行脫水前處理。

常規(guī)瓊脂糖包埋法：適用懸浮培養(yǎng)的類器官、易除膠且除膠后不破的空泡狀類器官、偏實心類器官。

原位瓊脂糖包埋法：適用除膠后易碎的類器官、或數(shù)量較少的類器官。

一、類器官包埋
1、常規(guī)瓊脂糖包埋法
（1）類器官收集
a、類器官直徑在 200um 左右收集類器官。
b、移液槍吸去培養(yǎng)基，每孔添加 1-2ml 4℃ 類器官傳代培養(yǎng)緩沖液（abs9730）放置2min，此過程保持動作輕柔。
c、移液槍輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在 15ml 離心管中，4℃靜置 30min。（每4 孔為一組）
d、離心 5min 棄去上清，用 200ul 移液器吸取多余基質(zhì)膠，此步驟盡量去除多余基質(zhì)膠，類器官收集后，添加組織固定液重懸，轉(zhuǎn)移到 1.5mlEP 管中（在類器官轉(zhuǎn)移過程中用血清潤洗槍頭防止類器官掛壁）。

（2）瓊脂糖包埋
a、取 0.2 到 0.4 克的瓊脂糖粉末，加入 10 毫升的去離子水緩沖液中，放入水浴鍋內(nèi) 65-70℃加熱至完全融化。使用移液槍吸取融化后的瓊脂糖溶液0.6 毫升，轉(zhuǎn)移至新 1.5 毫升離心管內(nèi)。
b、取 0.5 毫升離心管，將其插入 1.5 毫升離心管中，等待瓊脂糖凝固后，取出 0.5 毫升離心管，形成凹槽。
c、類器官加入 30ul 伊紅進行預(yù)染，顛倒混勻后進行離心，1000 轉(zhuǎn) 5分鐘，棄掉多數(shù)上清，底部保留20-30ul上清，將沉淀吹勻，然后將懸液加入到步驟 2 形成的凹槽中，加入 PBS 緩沖液稍微覆蓋過瓊脂糖。
d、離心 1000 轉(zhuǎn)，離心 5min，去除上清液。該步驟重復(fù)兩次，洗去殘留的多聚甲醛和伊紅。
e、離心完成后，向凹槽中加入適量的瓊脂糖，使用移液槍輕輕吹吸，使瓊脂糖完整包裹住類器官。
f、待瓊脂糖室溫凝固后，取出瓊脂塊。
g、瓊脂塊放入離心管內(nèi)，多聚甲醛浸泡處理 12h。

2、原位瓊脂糖包埋法
（1）類器官收集
a、類器官直徑在 200um 左右收集類器官。
b、移液槍吸去培養(yǎng)基（不要碰到膠滴），每孔添加 1.5ml 多聚甲醛直接固定（固定12h）。

3、瓊脂糖包埋
a、在 24 孔板中滴入伊紅 20ul，并用移液槍輕輕吹打混勻，靜止 5min，對膠滴進行初步染色處理。
b、使用移液槍輕輕觸動膠滴，讓膠滴與孔板底部分離，去除多聚甲醛并用PBS 清洗去除殘余多聚甲醛。
c、取 0.2 到 0.4 克的瓊脂糖粉末，加入 10 毫升的去離子水緩沖液中，放入水浴鍋內(nèi) 65-70℃加熱至完全融化。使用移液槍吸取融化后的瓊脂糖溶液加入 24 孔板中，用移液槍調(diào)整膠滴位置，使膠滴懸浮在瓊脂糖溶液中。
d、冷卻后修除多余瓊脂塊，只留下含有膠滴的區(qū)域。

大家了解了上述兩種瓊脂糖包埋方法以后，接下來我們來了解瓊脂糖的脫水及石蠟包埋方法。

二、脫水
1、梯度乙醇進行脫水處理，依次使用 70%、80%、90%和 95%的乙醇各浸泡 40 分鐘。
2、使用無水乙醇中浸泡 40 分鐘，重復(fù)兩次，徹底脫水。
3、使用無水乙醇與二甲苯按 1:1 的比例混合的溶液浸泡樣本 30 分鐘。
4、使用二甲苯中浸泡兩次，每次 30 分鐘。
5、完成上述步驟后，將樣本放入 60℃的蠟缸中進行浸蠟處理，重復(fù)兩次，每次 30 分鐘，之后進行包埋。

三、石蠟包埋
1、將包埋模具中加入適量蠟液，瓊脂塊放入模具正中央后移動至包埋機冷凍臺，待底部泛白凝固后，將包埋盒放在包埋模具上，加入蠟液填滿包埋盒。
2、將包埋模具放在凍臺上等待蠟液完全凝固后方可脫模。

四、切片
1、將包埋好的蠟塊體放入-10℃的冷凍環(huán)境中冷凍 5 分鐘，將包埋塊夾在樣本夾。
2、調(diào)整刀座與包埋塊的距離，先進行粗修，直至組織（瓊脂塊）露出大約80%。
3、繼續(xù)進行細修，直至組織露出大約 95%，或者在顯微鏡下觀察到瓊脂塊中有 細胞為止。
4、將切好的切片放置在 45℃的溫水中展平，直到?jīng)]有褶皺，使用玻片撈出。
5、根據(jù)組織和瓊脂塊的具體情況，適當(dāng)調(diào)整切片的厚度。
6、將切片寫上編號后，放入烤箱中在 65℃的溫度下烘烤 2 小時。

五、HE 染色步驟
1、脫蠟至水
（1）脫蠟過程：將石蠟切片依次浸入 3 道二甲苯中，每個 5 分鐘，以溶解石蠟。
（2）水化過程：使用梯度酒精（從 100%開始遞減至 70%），依次浸泡 5 分鐘，最后用蒸餾水浸洗 1 分鐘，玻片沒有水霧就可以進行后續(xù)染色。

2、蘇木精染色
（1）染色過程：在切片上滴加蘇木精染液，持續(xù) 5 分鐘后，用流水沖洗，以去除多余的染液。
（2）分化過程：使用分化液對切片進行分化處理，持續(xù) 10 秒后，再次用流水沖洗，去除多余的分化液。
（3）返藍過程：使用返藍液對切片進行返藍處理，持續(xù) 10 秒后，用流水沖洗，去除多余的返液。

3、伊紅染色
染色過程：在切片上滴加伊紅染液，持續(xù) 2 分鐘后，用流水沖洗，去除多余的伊紅。

4、脫水與透明
（1）脫水過程：使用梯度酒精（從 70%開始遞增至 100%），每種濃度浸泡 2 分鐘，確保徹底脫水。
（2）透明過程：將切片放入 2 道二甲苯中，每個浸泡 5 分鐘，使組織變得透明。

5、封片
封片過程：在組織上滴加適量的中性樹膠，蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，自然晾干。

今天講解就到這了，大家如有實驗問題，歡迎入群交流哦！

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